Dies ist eine HTML Version eines Anhanges der Informationsfreiheitsanfrage 'Request to EFSA for scientific opinion on "new GMOs"'.

Document 08






Adviesraad voor Bioveiligheid
Conseil consultatif de Biosécurité 
 
 
Compilation of comments of the experts in charge of evaluating  
notification B/BE/19/V1 
 
Ref. SC/1510/BAC/19_0178 
 
Coordinator: 
 (VUB) 
Experts: 
  (VIVES), 
  (ULg), 
  (Sciensano, 
GMOLAB) en 
 (Sciensano, GMOLAB) 
SBB: 
 
 
 
INTRODUCTION 
 
Dossier  B/BE/19/V1  concerns  a  notification  of  the  VIB,  for  deliberate  release  in  the  environment  of 
genetically modified higher plants (GMHP) according to Chapter II of the Royal Decree of 21 February 
2005.  
 
The notification has been officially acknowledged on 09 January 2019 and concerns a field trial with a 
maize with an impaired DNA-repair mechanism. 
 
Experts  were  invited to evaluate the genetical y modified organisms considered  in the notification as 
regards  their  potential  impacts  on  the  environment,  including  human  and  animal  health,  and 
information relating to pre- and post-release treatment of the site. 
The comments of the experts are roughly structured as in  
- Annex II (principles for the risk assessment) of the Royal Decree of 21 February 2005  
- Annex III (information required in notifications) of the Royal Decree of 21 February 2005 
- Commission  Decision  2002/623/EC  of  24  July  2002  establishing  guidance  notes  supplementing 
Annex II to Directive 2001/18/EC. 
 
Comments  sent to  the  VIB  are  indicated  in  grey.  It  should  be noted  that  all  the  comments  received 
from the experts are considered in the evaluation of this dossier and in formulating the final advice of 
the Biosafety Advisory Council. 
 
 
 
 
Biosafety Advisory Council - 
Service Biosafety and biotechnology (SBB) 
 Rue Juliette Wytsmanstraat 14   B-1050 Brussels   Belgium 
T + 32 2 642 52 93   xxx@xxxxxxxxx.xx   www.bio-council.be 
 
SC/1510/BAC/19_0178_  
p1/9 
 

LIST OF COMMENTS RECEIVED 
 
The  comments  below  have  served  as  a  basis  for  a  list  of  questions  that  the  competent  authority 
forwarded to the notifier with a request to provide additional information. The comments highlighted in 
grey correspond to the questions/comments selected and sent to the notifier. 
 
 
1. 
INFORMATION RELATED TO THE RECIPIENT OR (WHERE APPROPRIATE) PARENTAL PLANTS 
(e.g. reproduction, survivability, dissemination, geographic distribution,...) 
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
Page 4: it is mentioned that the maize plants will be detasseled; this is in contradiction with p 15 
and 17 where it is said that some plants wil  not be detasseled (G1b and G4). See further 
 
2. 
INFORMATION RELATED TO THE GENETIC MODIFICATION 
(e.g. methods used for the modification, description of the vector,...) 
 
Comment 1  
C1 Page 7: off target analysis; provide info about in silico analysis to guarantee specificity. Are 
there ATR and/or ATM homologues? 
 
C2 Page 9: plasmid; provide a legend and info on the guides 
 
Where  are  the  guides  situated?  Provide  scheme  of  the  gene  (exons/introns)  and  position 
guides. 
The deletion in ATRA is unusual big (1200 bp): did VIB use two guides? 
 
Comment 2  
As pointed out by the SBB/BAC, this is the first dossier with CRISPR/Cas9 modified plants and, 
to  the  best  of  my  knowledge,  no  European  guidelines  are  available  for  the  molecular 
characterization and risk assessment of such genetical y-modified  plants. However, taking into 
account the principles and requirements of transgenic plants, the following information might be 
relevant for the risk assessment of such plants: 
1)  The  risk  assessment  needs  to  consider  both  intended  and  unintended  effect  of  the 
genetic  modification.  Regarding  CRISPR/Cas9  edited  plants,  the  design  of  the  guide-
RNAs  is  a  critical  step  to  minimize  off-target  mutations.  Little  information  is  provided  at 
this  level.  The  applicant  claims  that  the  guide-RNAs  were  designed  in  such  a  way  to 
minimize  possible  matches  with  other  sites  of  the  maize  genome,  but  which  stringency 
criteria  were  applied  and  with  which  results  are  worth  describing  in  the  dossier.  For 
instance,  whether  and  which  possible  secondary  targets  were  identified  by  the 
bioinformatic  analysis  would  be  interesting  to  know.  In  case  such  sites  are  identified, 
targeted sequencing in the final GM events could be performed. Discussing possible off 
targets  is  of  relevance  from  the  point  of  view  of  the  aim  and  justification  of  the  trial 
(probably more than for identifying possible hazards and risks). 
2)  Out-segregation of the effector molecules Cas9 and guide-RNAs needs to be confirmed. 
In  this  dossier  both  phenotypic  characterization  via  linked  herbicide  resistance  marker 
 
 
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SC/1510/BAC/19_0178_  
p2/9 
 

(glufosinate in this dossier) and molecular characterization by PCR allowed to rule out the 
persistence of these sequences in the final GM plants conducted to the field trial ing. 
3) Description of the mutation and of the likely expressed peptides resulting from the genetic 
modification.  In  two  out  of  the  three  mutations  introduced,  single  nucleotide  additions 
have been obtained. The consequences of such additions depend on their location in the 
mutated gene (/ORF). New polypeptides are likely to result from frameshift mutations. As 
these changes are intentionally introduced into the GM plants, they could be detailed by 
the  application.  The  same  holds  true  for  the  intended  deletion  caused  by  the  third 
mutation. In case new peptides are produced, bioinformatic analysis could provide insight 
into  their  potential  al ergenicity  and  toxicity,  as  it  is  done  for  the  newly  expressed 
polypeptides in transgenic GMOs. However, extensive bioinformatic analysis of the newly 
expressed peptides is not required within the scope of field trials, hence this information 
should not be demanded for CRISPR/Cas9-edited plants. 
 
Comment 3: 
In  order  to  allow  detection  of  the  modified  lines,  it  would  be  relevant  to  know  if  the  induced 
mutations occur naturally in maize. 
 
Note SBB
 
1. needs to give an estimation of the copy number. In line with this, we think it is worthwhile 
to ask for information on the number of ATR and ATM (homologue) genes in maize. 
2. does not need to analyse which maize genes have been interrupted due to the insertion 
of  a  new  DNA  construct.  In  line  with  previous  field  trial  evaluations  we  consider  that 
information  on  which  off-target  mutations  have  occurred  (through  targeted  sequence 
analysis), should not be asked in the early stages of development. 
 
3. 
INFORMATION RELATED TO THE GENETICALLY MODIFIED PLANT 
 
3.1.  Information  related  to  the  traits  and  characteristics,  which  have  been  introduced  or 
modified 
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
We are dealing here with a special case, where the intended modification is to enhance the rate 
of stress-induced mutations. In other words, the intended effect of the targeted mutations is to 
enhance the rate of non-targeted mutations. However, as described by the applicant, previous in 
vitro  experiments  have  indicated  that  reduced  growth  is  observed  upon  chemical  treatments 
diminishing  the  rate  of  DNA  replication,  but  not  in  greenhouse  conditions,  suggesting  that 
detrimental effects become evident in specific conditions only. Overall, the available information 
suggests  a  possible  reduction  of  fitness  of  the  GM  plant,  as  compared  with  the  parental 
genotype,  but  no  increase  that  might  impact  the  persistence  and  invasiveness  of  the  plant, 
which is a key issue in the environmental risk assessment. 
 
3.2.  Information on the molecular characteristics of the final GMO 
(e.g. number of copies of the transgenes,...) 
 
Comment 1  
D1 and D2: it is mentioned that no donor material is present in the crispr cas lines. 
 
 
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p3/9 
 

It is  mentioned in Bijlage  2  that  (q)PCR  was performed  to  demonstrate  absence of  backbone; 
these data are not shown/ Please provide data demonstrating the absence of donor material. 
Comment 2  
Many of the characteristics of transgenic GM plants subjected to molecular analysis (e.g. copy 
number,  integrity,  expression  of  the  introduced  sequences)  are  not  applicable  to  edited  GM 
plants. 
 
3.3.  Information on the expression (of the insert) 
(e.g.  parts  of  plants  where  the  insert  is  expressed,  (expected)  expression  of  the  insert  during  the 
lifecycle of the plant,...)  
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
Not applicable. 
 
3.4.  Information on how the GM plant differs from the recipient plant 
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
See comments in 3.1. 
 
3.5.  Genetic stability of the insert and phenotypic stability of the GMHP 
 
Comment 1  
Page  12  D5 
investigate whether 
 
 
Comment 2  
The  applicant  explains  that  no  genetic  instability  is  expected  for  the  introduced  genetic 
modification,  which  should  behave  like  any  other  mutations.  It  is  also  mentioned  that  the 
phenotypic  stability  will  be  studied  during the  field  trial.  I  do  not  understand  which  phenotypic 
traits wil  actually be followed. If we refer to section D4a), no phenotype distinguishing the GM 
plant  from  the  reference  line  B104  is  well  established,  a  delay  of  flowering  being  the  only 
expected phenotype based on greenhouse observations. The trial can hardly study at the same 
time  which  phenotypic  trait  characterizes  the  GM  plant  and  how  stable  is  this  property. 
Furthermore,  whether  the  genetic/phenotypic  stability  can  be  studied  at  al   in  only  one 
generation of field-trial ed material is questionable. The applicant should clarify these issues. 
 
Note SBB and coordinator: Information on which phenotypic characteristics wil  be measured 
in the field, is not a risk assessment-related question. 
 
3.6.  Any change to the ability of the GMHP to transfer genetic material to other organisms 
 
 Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
 
 
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p4/9 
 

3.7.  Information  on  any  toxic,  allergenic  or  other  harmful  effects  on  human  health  arising 
from the genetic modification 
Comment 1  
Page 13 D7: effect of environmental stress at DNA level; see further 
 
Comment 2   
The  increased  rate  of  mutations  expected  in  the  GM  plants  potential y  leads  to  new  peptides 
and the accumulation of intermediate metabolites, both raising potential safety issues. However, 
this corresponds to an increased frequency of events which spontaneously happen in the maize 
genome  and  have  not  raised  any  safety  issues  so  far.  Furthermore,  the  field  trial  is  a 
fundamental research aiming at quantifying the impact of environmental stress on the frequency 
of  mutations  and  the  role  of  the  knocked-out  genes  at  that  level.  In  conclusion,  no  further 
information on the potential toxic or al ergenic constituents of the GM plant seems necessary. 
 
3.8.  Information on the safety of the GMHP to animal health, particularly regarding any toxic, 
allergenic or other harmful effects from the genetic modification, where the GMHP is intended 
to be used in animal feedstuffs 
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
See comments under 3.7 above. 
 
3.9.  Mechanism of interaction between the genetically modified plant and target organisms (if 
applicable) 
 
 Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
3.10.  Potential  changes  in  the  interactions  of  the  GMHP  with  non-target  organisms  resulting 
from the genetic modification 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
3.11.  Potential interactions with the abiotic environment 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
3.12.  Description of detection and identification techniques for the GM plant 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1: 
We want to note that the provided protocol only al ows detection of nucleotide modifications in 
(planted) homozygote material. With this protocol one is unable to check heterozygous material 
for  nucleotide  modifications,  if  requested.  For  example,  one  wil   not  be  able  to  verify  whether 
GM  pollen  have  contaminated  maize  occurring  in  the  surroundings.  For  the  latter,  more 
appropriate methods that can distinguish with sufficient sensitivity single nucleotide differences 
need to be applied (e.g. NGS or digital PCR). We welcome any feedback on this observation. 
 
 
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p5/9 
 

Annex 9 gives the sequences of the oligonucleotide primers proposed for the PCR detection of 
the  modified  ATR and  ATM  genes,  but  the  exact  map  locations  of  these  primers  are  not 
indicated. The position of the primers and their targets have to be il ustrated by a figure. Further, 
the  amplicon  sequence  should  be  provided  to  be  able  to  analyse  the  sequence.  Final y,  data 
should  be  provided  to  demonstrate  that  the  method  is  working  (e.g.  PCR  with  gel  and 
visualisation of the PCR fragment, sequencing results and analysis, such as a BLAST or other 
type of sequence alignment). 
 
3.13.  Information about previous releases of the GM plant, if applicable 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
4. 
INFORMATION RELATING TO THE SITE OF RELEASE  
(e.g. description of the site ecosystem, presence sexually compatible species, proximity of protected 
areas, ...) 
 
 Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
5. 
INFORMATION RELATING TO THE RELEASE  
(e.g. purpose of release, dates and duration of the release, methods for preparing and managing the 
release site, number of plants, ...) 
 
Comment 1  
Purpose of the release: 
It is mentioned that the aim of the trial is to monitor the GMO plants in the field. 
It is advisabl
methods that wil  be used to analyze the plants from the trial (NGS for mutations?). It is not clear 
modified  phenotype 
while  it  was stated  several times  that the lines  do not show  a  phenotype as compared  to WT 
plants. 
F1) 
 
Environmental  pol ution:  the  GMO  maize  wil   be  planted  in  a  classic  non-polluted  field.  What 
does VIB mean by environmental pollution? This needs more explanation. Also VIB is hoping for 
not  be control ed in the field,  while  in  the  greenhouse, 
conditions such as light and drought and other stresses can be well regulated. 
 
Note SBB and coordinator: The specific analyses and methodologies that will be used during 
the trial and the information the applicants want to obtain from this trial, are not relevant for risk 
assessment; consequently, there is no need to ask for further clarification. 
 
Comment 2  
The applicant proposes to cultivate the plot with commercial maize the year after the trial, based 
on the absence of any regrowth of GM maize following previous releases since 2012. However, 
I have no access to the information about the post-release operations in the previous trials and 
on how the monitoring of the possible regrowth was performed, hence it is difficult to validate the 
claims of the applicant.   
 
 
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p6/9 
 

 
Note SBB: The monitoring reports of B/BE/11/V4 and B/BE/14/V2 state that no volunteers were 
found in years fol owing the trial.
 
6. 
INFORMATION RELATED TO THE RISKS FOR THE ENVIRONMENT  
 
6.1.  Information on the likelihood for the GMHP to become more persistent than the recipient 
or parental plants or more invasive  
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
6.2.  Information on the selective advantage or disadvantage conferred to the GMHP 
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
6.3.  Information  on  potential  of  gene  transfer  to  other  sexually  compatible  plant  species 
under conditions of planting and its consequences  
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
6.4.  Information on the environmental impact resulting from direct and indirect interactions of 
the GMHP with target organisms  
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
6.5.  Information on the environmental impact resulting from direct and indirect interactions of 
the GMHP with non-target organisms, including herbivores, parasites, symbionts...  
 
          Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
6.6.  Information  on  possible  effects  on  human  health  resulting  from  potential  direct  and 
indirect interactions of the GMHP and persons working with, coming into contact with or 
living in the vicinity of the GMHP release 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
6.7.  Information  on  possible  effects  on  animal  health  and  consequences  for  the  food/feed 
chain  resulting  from  consumption  of  the  GMO  and  any  product  derived  from  it,  if  it  is 
intended to be used as animal feed 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
6.8.  Possible immediate and/or delayed effects on biogeochemical processes resulting from 
potential direct and indirect interactions of the GMO and target and non-target organisms 
in the vicinity of the GMO release(s) 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
 
 
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p7/9 
 

6.9.  Information  on  environmental  impact  of  the  specific  cultivation,  management  and 
harvesting techniques used for the GMHP where these are different from those used for 
non-GMHPs
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
7. 
INFORMATION RELATED TO CONTROL, MONITORING, POSTRELEASE AND WASTE TREATMENT  
 
7.1.  Precautions taken  
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
G1b  page  16  and  G4  page  17:  why  wil   some  plants  not  be  detasseld?   
Is 
there a reason to assume that the lines wil  not produce pol en? 
Referee suggests to detassel al  plants (in order to avoid dispersal of pollen) 
 
7.2.  Information on methods for post release treatment of site 
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
See previous comment under section 5. 
 
7.3.  Information  on  post  release  treatment  methods  for  the  GM  plant  material,  including 
wastes  
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 1 expert 
 
Comment 1  
nd  leaves  are  considered  as  GMO  (due  to  the 
method  used  to  generate the  plants)  but  it  can  be  said  that  these  plant residues  do  not  pose 
harm for the environment since these plant residues wil  break down. 
 
7.4   Information related to monitoring plans and the detection techniques  
 
Have evaluated this section and have no comments/questions: 2 experts 
 
7.5.  Information on the emergency plan(s) proposed by the notifier 
 
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Biosafety Advisory Council - 
Service Biosafety and biotechnology (SBB) 
 Rue Juliette Wytsmanstraat 14   B-1050 Brussels   Belgium 
T + 32 2 642 52 93   xxx@xxxxxxxxx.xx   www.bio-council.be 
 
SC/1510/BAC/19_0178_  
p8/9 
 

7.6.  Information on methods and procedures to protect the site  
 
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I could not find this information in the dossier. 
 
Note SBB: information can be found in G.6  
 
8. 
OTHER INFORMATION 
 
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guidelines for the risk assessment of CRISPR-edited GM plants are lacking. It might be useful to 
see whether such information is available from other competent authorities in EU (and/or from 
EFSA or ISPRA JRC?). 
 
 
Biosafety Advisory Council - 
Service Biosafety and biotechnology (SBB) 
 Rue Juliette Wytsmanstraat 14   B-1050 Brussels   Belgium 
T + 32 2 642 52 93   xxx@xxxxxxxxx.xx   www.bio-council.be 
 
SC/1510/BAC/19_0178_  
p9/9