Dies ist eine HTML Version eines Anhanges der Informationsfreiheitsanfrage 'Request to EFSA for scientific opinion on "new GMOs"'.






Document 07
Ref. Ares(2020)1869064 - 01/04/2020
Biosécurité et Biotechnologie
Advice of the Biosafety and Biotechnology Unit (SBB)
concerning genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system
Summary
The SBB is of the opinion that the genetic modifications achieved in the plants to be released in the 
field as described in the present request are similar in type and extent to those that can be obtained
via natural or induced (using chemical or physical agents) mutagenesis. Genome editing in plants 
using the CRISPR/Cas9 system as described in the present request can thus be considered as a
form of mutagenesis.
The SBB is of the opinion that genome editing in plants using the described CRISPR/Cas9 system
does not raise additional safety concerns as compared to the conventional mutagenesis 
techniques.
The SBB is of the opinion that the intermediate plants containing an exogenous T-DNA cassette
encoding the components of the CRISPR/Cas9 system have been developed using a recombinant 
nucleic acid technique. They should therefore be considered as GMOs according to the Belgian 
Royal Decree on GMOs of 21 February 2005.
When the T-DNA cassette encoding the components of the CRISPR/Cas9 system has been
effectively segregated away, the SBB is of the opinion that the resulting plants should not be 
considered as GMOs in the meaning of the GMO regulatory framework.
The SBB considers that the mutagenesis induced by the transient presence of the CRISPR/Cas9 
system as described in the present request is a technique of genetic modification that does not 
involve the use of recombinant nucleic acid molecules or genetical y modified organisms in the 
meaning of the chapeau of Annex I B of the Belgian Royal Decree on GMOs of 21 February 2005
(Annex I B of Directive 2001/18/EC).
Provided that the exogenous DNA used in the intermediate step (T-DNA cassette encoding 
the components of the CRISPR/Cas9 system) has been effectively removed by segregation, 
the SBB concludes that the genetically modified plants to be released in the field as
described in the present request should be considered for exclusion from the scope of the 
Belgian Royal Decree on GMOs of 21 February 2005, according to Annex I B of this Decree 
(Annex I B of Directive 2001/18/EC).
This conclusion applies to the field trial under consideration and to all cases where the 
CRISPR/Cas9 system is used according to the so-called SDN-1 approach, i.e. to generate site-
specific mutations (small nucleotide deletions and/or insertions - indels – at one target site, or 
deletions, duplications or inversions of DNA sequences between two target sites) without the 
simultaneous delivery of exogenous DNA (DNA template or full gene).
This conclusion applies only to the above-mentioned applications of the CRISPR/Cas9 technology
in plants.
This advice is delivered without prejudice to any further legal interpretation of the terms and 
provisions of the EU GMO directives (2001/18/EC and 2009/41/EC) adopted at Belgian or EU level.
5 July 2016
WIV-ISP/41/SBB_2016_0445
1/7



Background
On 16 June 2016 the Biosafety and Biotechnology Unit (SBB) received a request to advise the Federal 
Competent Authority (Federal Public Service (FPS) Health, Food Chain Safety and Environment) about 
the GMO status within the meaning of the Belgian Royal Decree of 21 February 2005 (AR-KB, 2005) of 
certain plants genetically modified using the CRISPR/Cas9 technique.
This request was made fol owing a question from a Belgian research institute whether or not the GMO 
regulatory framework should be applied for field trials with certain CRISPR/Cas9-modified plants.
To substantiate the request a short description of the plants to be tested in the field was provided by the 
Belgian research institute. The plants described were transformed using disarmed Agrobacterium 
tumefaciens with CRISPR/Cas9 containing T-DNA constructs. As a result of the cel ’s natural DNA-
repair process at the double strand breaks induced by the CRISPR/Cas9 system (and without the use 
of exogenous homologous DNA template) point mutations or short deletions were created at target loci 
in the plant genome. Once the targeted genomic changes have been achieved, the introduced T-DNA 
constructs containing the components of the CRISPR/Cas9 system were removed by segregation to 
generate plants (those to be tested in the field) that do not contain exogenous DNA anymore.
To prepare its advice the SBB has taken into consideration the information provided by the Belgian 
research institute, as well as the scientific literature and other relevant information dealing with genome-
editing techniques (summarized in the introduction below).
Introduction
Plant breeding: From natural mutations to conventional mutagenesis
Genetic variation is common in plant species as a result of several factors including retrotransposons 
(“jumping genes”), single base pair polymorphisms (SNPs), horizontal gene transfer and mutations. 
This extensive genetic variation served as a basis to select new plant varieties.
Mutations occur naturally and sometimes result in the development of new beneficial traits. However,
the frequency of such mutations (e.g. not more than 10–5 to 10–8 per gene or locus in one plant 
generation) is too low to rely on for accelerated plant breeding (EFSA, 2012).
Since World War II, the application of mutation techniques (mutagenesis) has generated a vast amount 
of genetic variability and is playing a significant role in plant breeding. Mutation breeding is particularly 
valuable in those crops with restricted genetic variability or where introgression of genes from wild 
relatives is difficult and time-consuming. The widespread use of mutation techniques in plant breeding 
programmes throughout the world has generated more than 3200 official y released mutant varieties 
from 214 different plant species (FAO/IAEA Mutant Variety Database, https://mvd.iaea.org/).
Conventional mutagenesis techniques are based on the fact that chemicals (such as ethyl methane 
sulphonate – EMS) or irradiation (non-ionising - e.g. UV - or ionising radiation - e.g. X-rays, gamma 
rays) induce damage to DNA, including double-strand breaks (DSBs), that is not always faithfully 
repaired. Two mechanisms of DSB repair can be used by the cel , the non-homologous end joining
(NHEJ) pathway or homologous recombination (HR)-based repair. In eukaryotic somatic cel s, including 
plant cells, the NHEJ pathway is general y preferred (EFSA, 2012). The NHEJ repair simply re-joins the 
broken DNA ends without the use of a homologous template. This can result in unfaithful repair, 
creating nucleotide insertions and/or deletions (indels). HR plays a major role during meiosis. During 
HR, nucleotide sequences are exchanged between two very similar or identical DNA molecules.
Although conventional mutagenesis has been widely applied, there are two serious limitations to the 
use of induced physical and chemical mutagenesis (EFSA, 2012): (i) the deleterious effects associated 
with most newly introduced mutations and (ii) the untargeted and unspecific character of the processes.
From a large mutagenized population, extensive selection and backcrossing is subsequently required to 
identify desirable phenotypes and eliminate the undesirable ones.
5 July 2016
WIV-ISP/41/SBB_2016_0445
2/7





Genome-editing techniques
During the past decade, genome-editing (or gene-editing) techniques have been developed that allow 
the direct modification of the plant genome at specific locations. They generally use nucleases that
cleave DNA at specific sites and trigger the plant’s own repair mechanisms. These so-cal ed “site-
directed nuclease” (SDN) techniques are evolving continuously and rapidly, both in terms of their 
applications and the types of nucleases used. The later include zinc finger nucleases (ZFNs), 
transcription activator-like effector nucleases (TALENs), meganucleases (MN) and the clustered 
regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR/Cas9) system.
Applications of the SDN techniques are generally grouped in three categories (figure 1):
- In SDN-1 applications, only the SDNs are introduced (stably or transiently), generating site-specific 
point mutations, short insertions/deletions (indels) or excision by NHEJ.
- In SDN-2 applications, a homologous repair DNA template (donor DNA) is introduced together with 
the SDN complex to induce specific nucleotide sequence changes by HR. This approach can result in 
minor or more substantial changes to the nucleotide sequences of the target gene.
- In SDN-3 applications, a large stretch of exogenous donor DNA (up to several kilobases) is introduced 
together with the SDN complex to target DNA insertion into a predefined genomic locus. The insertion 
can take place either by HR or by NHEJ.
Figure 1: Applications of site-directed nuclease (SDN) techniques (Source: EFSA, 2012)
The components of the SDN system (nuclease and possibly guide RNA) can be delivered into the plant 
cel s in different ways. A commonly used approach involves the stable integration and constitutive 
expression of the SDN-encoding gene(s) into the host genome. Once the SDN-mediated targeted 
mutation of the plant genome has been achieved, the introduced SDN gene(s) can be removed by 
segregation.
To circumvent the integration of SDN encoding sequences as foreign DNA, transient delivery can be 
achieved using for example non-integrative DNA-based expression plasmids, some viral vectors or 
nuclease encoding mRNAs. In some cases, the components of the SDN system themselves can be 
delivered (see e.g. Woo et al., 2015 and Subburaj et al., 2016 for CRISPR/Cas9).
The CRISPR/Cas9 system
CRISPR is an acronym for “clustered regularly interspaced short palindromic repeats” and Cas9 is a 
nuclease associated with CRISPR. The CRISPR/Cas9 system is derived from the adaptive immune 
system of some bacteria and represents the most recent generation of genome editing techniques. Site-
5 July 2016
WIV-ISP/41/SBB_2016_0445
3/7



specific modification is achieved by a single guide RNA (sgRNA, usually about 20 nucleotides) that is 
complementary to a target gene or locus and is anchored by a protospacer adjacent motif (PAM). Cas9 
nuclease then cleaves the targeted DNA to generate double-strand breaks, eliciting a response from 
the cel s’ DNA repair machinery.
In plants, the use of the CRISPR/Cas9 system is recent but the number of applications of this system 
as a genome engineering tool is increasing rapidly (see e.g. reviews by Bortesi and Fischer, 2015; Luo 
et al., 2016; Song et al., 2016).
Plant genome editing and off-target mutations
Specificity is an important endeavour for al  genome editing technologies, including CRISPR/Cas9
(Marx, 2014). Sequence-specificity of SDN is not absolute and cleavage can occur at sites similar to but 
different from the target site. Since this could possibly result in unintended mutations or translocations, 
efforts have been done to predict and reduce such off-target activity (COGEM, 2014; Pauwels et al., 
2014). In relation to the CRISPR/Cas9 system such efforts focus on the sgRNA and the PAM motif that 
were shown to predominantly confer target specificity of the system. Off-target effects associated with
the CRISPR/Cas9 system can also be minimised by selecting target sequences that have reduced 
numbers of off-target homologues in the genome (bioinformatics tools can be used for that purpose).
Novel types of Cas9 proteins have also been discovered that could contribute to reduce ‘off-site’ 
targeting (Belhaj et al., 2013; Song et al., 2016).
In plants, the few studies published so far reported low to negligible off-target activity compared to
animal systems (Belhaj et al., 2015, Weeks et al., 2016). In any case, the frequency of off-target 
mutations caused by the SDN-1 approach is considered to be well below the frequency of unwanted 
mutations resulting from chemical or physical mutagenesis agents, for example, one mutation per 150 
kbp can be effected by EMS treatment in Arabidospsis (EFSA, 2012; Green et al., 2003; Podevin et al.,
2012). Furthermore, as in conventional breeding, unintended mutations can be segregated away during 
the selection and breeding process.
Regulatory considerations
Under the GMO legislation, a genetically modified organism is “an organism […] in which the genetic 
material has been altered in a way that does not occur natural y by mating and/or natural 
recombination” (AR-KB, 2005; EU, 2001). This definition is intrinsical y linked to:
- A non-exhaustive list of techniques of genetic modification leading to a GMO (Annex I A, Part 1 of AR-
KB, 2005). It includes recombinant nucleic acid techniques, techniques in which genetic material 
prepared outside the organism is introduced directly into the organism (for example by microinjection), 
and cel  fusion or hybridisation techniques where live cel s with new combinations of heritable genetic 
material are formed;
- A list of techniques/methods of genetic modification yielding organisms to be excluded from the 
Directive (Annex I B of AR-KB, 2005), which includes mutagenesis. The exclusion of these 
techniques/methods is possible only on the condition that they do not involve the use of recombinant 
nucleic acid molecules or GMOs.
Plants genetically modified by conventional mutagenesis techniques are therefore exempted from the 
EU GMO legislation. The main argument underlying this exemption is that these techniques have
conventional y been used in a number of applications and have a long safety record (recital 17 of 
Directive 2001/18/CE).
The regulatory status of genome-edited organisms is a matter of intense discussion by regulators and 
the scientific community (see e.g. Podevin et al., 2012; Wolt et al., 2016). In relation to the SDN-1
approach the question is whether applications of the system fal  under the definition of genetic 
modification (and therefore under the GMO legislation) or whether they could be exempted from the 
GMO legislation by analogy to conventional mutagenesis.
From a science-based perspective, there are arguments supporting the view that the SDN-1 approach 
can be considered a form of mutagenesis (ACRE, 2013; EFSA, 2015; Lusser and Davies, 2013;
NTWG, 2012) and that the resulting organisms are not likely to differ from products obtained by 
conventional breeding or conventional mutagenesis in terms of risks posed to human health or 
5 July 2016
WIV-ISP/41/SBB_2016_0445
4/7



environment, especial y if the transgenes for the machinery used for genome editing are absent from 
the final product (Podevin et al., 2013). It was also pointed out that in many cases such organisms 
cannot be distinguished from non-modified organisms, raising questions about the enforceability of the 
GMO regulations (COGEM, 2014; Lusser et al., 2012; Lusser and Davies, 2013). These arguments, in 
addition to others linked to the interpretation of the GMO legislation, led several EU member states to 
conclude that organisms obtained by the SDN-1 approach should be considered for exclusion from the 
GMO legislation (ACRE, 2013; BVL, 2015; HCB, 2016; Schaart and Visser, 2009; SWE, 2015). For 
others a precautionary approach should be adopted, taking into account the uncertainties and limited 
knowledge on the mode of action of certain types of modifications (Eckerstorfer et al., 2014).
Scientific assessment
Concerning the genetically modified plants to be released in the field
The SBB is of the opinion that the applications of the CRISPR/Cas9 system to develop the plants to be 
released in the field as described in the present request fal within the SDN-1 approach, i.e. an 
approach used to generate site-specific mutations (smal  nucleotide deletions and/or insertions -
Indels - at one target site, or deletions, duplications or inversions of DNA sequences between two target 
sites) via the transient presence of the CRISPR/Cas9 components.
The alterations of the genetic material (mutations) in the plants to be released in the field do not make 
use of an exogenous DNA template and occur via non-homologous end joining (NHEJ), which is a cell’s 
own error-prone process that frequently results in smal sequence insertions or deletions (indels).
The type of genetic modifications obtained is not similar to the type of genetic modifications that are 
usually obtained using recombinant nucleic acid techniques, direct introduction of heritable material 
prepared outside the organism, or cel  fusion or hybridisation techniques.
The type and extent of genetic modifications obtained is similar to what can be obtained by chemical 
mutagenesis, by irradiation or by spontaneous natural mutations, and are not distinguishable from 
them. The genetic modifications are a result of the cellular DNA repair mechanisms of the host and can 
occur natural y.
Off-target changes induced by applications of the CRISPR/Cas9 system as described in the present 
request are of the same type as those changes produced by conventional breeding techniques, 
therefore not raising additional safety concerns. Moreover, unintended mutations can be segregated 
away during the selection and breeding process.
Applications of the CRISPR/Cas9 system as described in the present request can be considered a
refinement of the conventional mutagenesis (using chemicals or ionizing radiation) with an increased 
specificity and fewer unintended effects. According to the GMO legislation conventional mutagenesis
encompasses techniques of genetic modification that have conventionally been used in a number of 
applications and have a long safety record.
Concerning the intermediate genetically modified plants containing the T-DNA
At an early and intermediate step in the development of the plants to be released in the field a T-DNA 
cassette encoding the components of the CRISPR/Cas9 system is stably introduced into the plant 
genome. The SBB is of the opinion that the corresponding intermediate plants have been developed 
using a recombinant nucleic acid technique. They should therefore be considered as GMOs and their 
potential risks for human health and the environment assessed accordingly.
When the T-DNA cassette encoding the components of the CRISPR/Cas9 system has been effectively
segregated away, the SBB is of the opinion that the resulting plants should not be considered as GMOs 
in the meaning of the GMO regulatory framework.
It is the responsibility of the user to ensure that these resulting plants are effectively free of exogenous 
DNA.
5 July 2016
WIV-ISP/41/SBB_2016_0445
5/7



The SBB considers that the development of the GM plants containing the T-DNA cassette on the one 
hand, and the mutagenesis induced by the transient presence of the CRISPR/Cas9 system on the other 
hand, are two distinct technical processes. The mutagenesis does not involve per se the use of 
recombinant nucleic acid molecules or genetical y modified organisms (the components of the 
CRISPR/Cas9 system can be delivered by other means into the plant cells).
Conclusions
In the light of the above-mentioned considerations the SBB is of the opinion that:
From a science-based perspective, the applications of the CRISPR/Cas9 system using the SDN-1
approach as described in the present request are a form of mutagenesis and do not raise additional 
safety concerns as compared to conventional mutagenesis techniques.
The mutagenesis induced by the transient presence of the CRISPR/Cas9 system as described in 
the present request is a technique of genetic modification that does not involve the use of 
recombinant nucleic acid molecules or genetical y modified organisms in the meaning of the 
chapeau of Annex I B of the Belgian Royal Decree on GMOs of 21 February 2005 (Annex I B of 
Directive 2001/18/EC).
The  SBB  therefore  concludes  that  provided  that  the  exogenous  DNA  (T-DNA  cassette  encoding  the 
components of the CRISPR/Cas9 system) used in the intermediate step has been effectively removed 
by segregation, the  genetical y modified  plants to  be  released  in  the  field  as described  in  the  present 
request should be considered for exclusion from the scope of the Belgian Royal Decree on GMOs of 21 
February 2005, according to Annex I B of this Decree (Annex I B of Directive 2001/18/EC).
This conclusion applies also to all cases where the CRISPR/Cas9 system is used in plants according to 
the SDN-1 approach.
This opinion is delivered without prejudice to any further legal interpretation of the terms and provisions 
of the EU GMO directives (2001/18/EC and 2009/41/EC) adopted at Belgian or EU level.
References
ACRE (2013). ACRE advice: New techniques used in plant breeding. Advisory Committee on 
Releases to the Environment. Available at https://www.gov.uk/government/publications/genetical y-
modified-organisms-new-plant-growing-methods
AR-KB (2005). Arrêté royal du 21 février 2005 réglementant la dissémination volontaire dans 
l’environnement ainsi que la mise sur le marché d’organismes génétiquement modifiés ou de 
produits en contenant (Moniteur belge - 24.02.2005 - Page 7129-7165) / Koninklijk besluit van 21 
februari 2005 tot reglementering van de doelbewuste introductie in het leefmilieu evenals van het in 
de handel brengen van genetisch gemodificeerde organismen of van producten die er bevatten
(Belgisch Staatsblad - 24.02.2005 - Bz 7129-7165).
Belhaj et al. (2013). Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop 
plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods 9, 39.
Belhaj et al. (2015). Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Curr. Opin. Biotechnol., 32:76–78.
Bortesi and Fischer (2015). The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond.
Biotechnol Adv. 33(1):41-52.
BVL (2015). BVL Opinion on the legal classification of New Plant Breeding Techniques, in particular 
ODM and CRISPR-Cas9. December 2015. Available at 
www.bvl.bund.de/SharedDocs/Downloads/06_Gentechnik/Opinion_on_the_legal_classification_of_
New_Plant_Breeding_Techniques.pdf?__blob=publicationFile&v=2
COGEM (2014). CRISPR-Cas - Revolution from the lab. COGEM Report and advice CGM/141030-
01.
EC (2001). Directive 2001/18/EC of the European Parliament and of the Council of 12 March 2001
on the deliberate release into the environment of genetically modified organisms and repealing 
Council Directive 90/220/EEC. Off. J. Eur. Union L 106, 1-38.
5 July 2016
WIV-ISP/41/SBB_2016_0445
6/7



EC (2009). Directive 2009/41/EC of the European Parliament and of the Council of 6 May 2009 on 
the contained use of genetical y modified micro-organisms. Off. J. Eur. Union L 125, 75-97.
Eckerstorfer et al. (2014). New Plant Breeding Techniques and Risks Associated with their 
Application. Wien, 2014. Reports, Band 0477. ISBN: 978-3-99004-282-3. 94 p. Available at 
http://www.umweltbundesamt.at/aktuel /publikationen/publikationssuche/publikationsdetail/?pub_id=
2054
EFSA (2012). EFSA Panel on Genetical y modified organisms (GMO); Scientific opinion addressing 
the safety assessment of plants developed using Zinc Finger Nuclease 3 and other Site-Directed 
Nucleases with similar function. EFSA Journal 2012;10(10):2943. [31 pp.] 
doi:10.2903/j.efsa.2012.2943. Available online: www.efsa.europa.eu/efsajournal
EFSA (2015). Answer of the European Food Safety Authority to a request from the European 
Commission (Mandate M-2015-0183) to provide technical assistance on issues related to the legal 
analysis of new plant breeding techniques [Ref. EW/AGe/AGo/MR/lg(2015)].
Greene et al. (2003). Spectrum of chemically induced mutations from a large-scale reverse-genetic 
screen in Arabidopsis. Genetics, 164, 731-740.
HCB (2016). Haut Conseil des Biotechnologies. Nouvel es techniques – New plant breeding 
techniques – Première étape de la réflexion du HCB – Comité scientifique.
Luo et al. (2016). Applications of CRISPR/Cas9 technology for targeted mutagenesis, gene 
replacement and stacking of genes in higher plants. Plant Cell Rep. 35(7):1439-50.
Lusser et al. (2012). Deployment of new biotechnologies in plant breeding. Nature Biotech. 
30(3):231.
Lusser and Davies (2013). Comparative regulatory approaches for groups of new plant breeding 
techniques. New Biotechnology, Volume 30, Number 5, June 2013, 437.
Marx (2014). Gene editing: how to stay on-target with CRISPR. Nature Methodology 11:1021-1025.
NTWG (2012). New Techniques Working Group. Final Report.
Pauwels et al. (2014) Engineering nucleases for gene targeting: safety and regulatory 
considerations. New Biotechnology 31(1):18-27.
Podevin et al. (2012). Transgenic or not? No simple answer! EMBO Rep. 13(12):1057–1061.
Podevin et al. (2013). Site-directed nucleases: A paradigm shift in predictable, knowledge-based 
plant breeding. Trends in Biotechnology 31, 375-383.
Schaart and Visser (2009). Novel Plant Breeding Techniques – Consequences of new genetic 
modification-based plant breeding techniques in comparison to conventional plant breeding. 
COGEM Research Report number 2009-02. The Netherlands Commission on Genetic Modification; 
2009.
Song et al. (2016). CRISPR/Cas9: A powerful tool for crop genome editing. The Crop Journal 4(2)2: 
75–82.
Subburaj et al. (2016) Site-directed mutagenesis in Petunia x hybrid protoplast system using direct 
delivery of purified recombinant Cas9 ribonucleoproteins. Plant Cell Rep 35(7):1535-44.
SWE (2015). Swedish Board of Agriculture, CRISPR/Cas9 mutated Arabidopsis, 2015. Available at: 
www.upsc.se/documents/Information_on_interpretation_on_CRISPR_Cas9_mutated_plants_Final.
pdf
Weeks et al. (2016), Use of designer nucleases for targeted gene and genome editing in plants. 
Plant Biotechnol J, 14: 483–495.
Wolt et al. (2016). The Regulatory Status of Genome-edited Crops. Plant Biotechnol J, 14: 510–
518.
Woo et al. (2015) DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR–Cas9 
ribonucleoproteins. Nat Biotechnol 33:1162–1164.
5 July 2016
WIV-ISP/41/SBB_2016_0445
7/7