This is an HTML version of an attachment to the Freedom of Information request 'Request to EFSA for scientific opinion on "new GMOs"'.


Document 14
SCIENTIFIC COMMITTEE 
SCIENTIFIC OPINION 
ON 
NEW PLANT BREEDING TECHNIQUES 
Paris, 2 November 2017 
(adopted by the Scientific Committee on 26 April 2017) 

Contents 
 
CONTENTS ....................................................................................................... 1 
SUMMARY ...................................................................................................... 4 
SCOPE OF THE OPINION.............................................................................................................................................. 4 
INTRODUCTION TO THE OPINION .................................................................................................................................. 5 
ASSESSMENT AND TRACEABILITY METHODS FOR PLANT AND PRODUCTS OBTAINED BY NPBTS .................................................. 5 
IMPLICATIONS FOR SUPPLY CHAIN COEXISTENCE (FROM FARM TO FORK) .............................................................................. 7 
DIRECT RISKS TO HEALTH AND THE ENVIRONMENT ASSOCIATED WITH NOVEL CHARACTERISTICS OF PRODUCTS OBTAINED ............... 8 
MANAGEMENT MEASURES REQUIRED TO PREVENT OR LIMIT RISKS TO HEALTH AND THE ENVIRONMENT ASSOCIATED WITH USE OF 
PRODUCTS OBTAINED BY NPBTS IF SUCH RISKS ARE IDENTIFIED .......................................................................................... 9 
PROPOSALS FOR INTERMEDIATE OPTIONS BETWEEN THE PROVISIONS OF THE EU CATALOGUE AND THOSE OF DIRECTIVE 2001/18/EC
 
10 
1.  INTRODUCTION ...................................................................................... 12 
1.1. 
BACKGROUND ........................................................................................................................................... 12 
1.2. 
WORK PROCESS ......................................................................................................................................... 13 
1.3. 
STATE OF THE ART AND QUESTIONS CONCERNING MUTATIONS AND NATURAL VARIATION ......................................... 13 
1.3.1.  GENERAL CHARACTERISATION OF NPBTS ....................................................................................................... 15 
1.3.2.  QUESTIONS RAISED BY NPBTS ..................................................................................................................... 17 
1.4. 
CONSIDERATIONS REGARDING NATURAL GENETIC VARIATION IN A PLANT SPECIES .................................................... 18 
1.4.1.  ORIGIN OF GENETIC VARIATIONS ................................................................................................................... 18 
1.4.2.  FATE OF GENETIC VARIATIONS: NATURAL EVOLUTION (NO HUMAN INTERVENTION) ................................................. 19 
1.4.3.  CHARACTERISTICS OF VARIATION WITHIN GENOMES .......................................................................................... 19 
1.4.4.  INTRA- AND INTERSPECIES VARIATION ............................................................................................................ 20 
1.4.5.  HUMAN SELECTION AND CROP EVOLUTION ...................................................................................................... 20 
1.4.6.  TARGETED MUTATIONS, OFF-TARGET MUTATIONS AND NATURAL VARIATION ......................................................... 21 
2.  DEFINITION OF TERMS AND TECHNIQUES ............................................... 22 
2.1. 
MULTIPLEX GENOME EDITING AND SIMULTANEOUS PRODUCTION OF MULTIPLE SITE-SPECIFIC MODIFICATIONS .............. 22 
2.2. 
BOUNDARIES BETWEEN SDN-1, -2 AND -3 ..................................................................................................... 23 
2.3. 
CONSIDERATIONS CONCERNING DELIVERY AND EFFECTOR INSERTION IN THE TARGET CELL ......................................... 23 
2.3.1.  TRANSFORMATION USING AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIA .................................................................. 24 
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS BACTERIA CAUSE CROWN GALL DISEASE IN SOME PLANTS .................................................... 24 
AGROBACTERIUM ................................................................................................................................................... 24 
2.3.2.  DIRECT TRANSFORMATION........................................................................................................................... 24 
2.4. 
METHODS FOR SELECTING MODIFIED CELLS AND PLANTS AND DELETING MARKER TRANSGENES .................................. 25 
2.5. 
WHOLE-PLANT REGENERATION ..................................................................................................................... 25 
2.6. 
TRANSIENT OR STABLE PLANT TRANSFORMATION ............................................................................................. 26 

 
 

2.6.1.  SDNS ...................................................................................................................................................... 26 
2.6.2.  RDDM .................................................................................................................................................... 26 
2.7. 
RELATIONSHIP BETWEEN DNA SEQUENCE MODIFICATIONS AND PHENOTYPE.......................................................... 27 
3.  ASSESSMENT AND TRACEABILITY METHODS FOR PLANTS AND PRODUCTS 
OBTAINED BY NPBTS (POINT 1 OF THE REFERRAL) ......................................... 28
 
3.1. 
BACKGROUND ........................................................................................................................................... 28 
3.1.1.  REGULATORY ENVIRONMENT ....................................................................................................................... 28 
3.1.2.  DEFINITIONS ............................................................................................................................................. 28 
3.1.3.  SCIENTIFIC COMMITTEE APPROACH ............................................................................................................... 30 
3.2. 
DETECTION OF PLANT AND PRODUCTS DERIVED FROM GMOS ............................................................................ 31 
3.3. 
DETECTION OF DELIVERY TECHNIQUE ............................................................................................................. 33 
3.3.1.  AGROBACTERIUM ...................................................................................................................................... 33 
3.3.2.  DIRECT TRANSFORMATION (PROTOPLAST, BIOLISTIC, ETC.) ................................................................................. 33 
3.3.3.  VIRUSES ................................................................................................................................................... 34 
3.4. 
EFFECTOR DETECTION ................................................................................................................................. 34 
3.5. 
OVERVIEW OF DETECTION OF PLANTS AND PRODUCTS OBTAINED BY NPBTS .......................................................... 34 
3.5.1.  A SUPPORTING DOCUMENT FOR NPBT DETECTION, IDENTIFICATION AND TRACEABILITY ........................................... 34 
3.5.2.  SUMMARY TABLES ..................................................................................................................................... 35 
3.5.3.  CONCLUSIONS ........................................................................................................................................... 39 
4.  IMPLICATIONS  FOR  SUPPLY  CHAIN  COEXISTENCE  (POINT  2  OF  THE 
REFERRAL IN CONNECTION WITH THE PREVIOUS POINT) ............................... 40
 
4.1. 
END PRODUCT VERSUS PLANT BREEDING METHOD ............................................................................................ 40 
4.2. 
IF DIRECTIVE 2001/18/EC WERE TO BE INTERPRETED AS EXCLUDING PLANTS OBTAINED BY SOME NPBTS .................. 41 
4.3. 
IF DIRECTIVE 2001/18/EC WERE TO BE INTERPRETED AS INCLUDING PLANTS OBTAINED BY SOME NPBTS .................. 41 
5.  DIRECT  RISKS  TO  HEALTH  AND  THE  ENVIRONMENT  ASSOCIATED  WITH 
NOVEL  CHARACTERISTICS  OF  PRODUCTS  OBTAINED  (POINT  3  OF  THE 
REFERRAL) ..................................................................................................... 42
 
5.1. 
RISKS ARISING FROM DESIRED TRAITS ............................................................................................................. 43 
5.1.1.  RISKS ASSOCIATED WITH MODIFICATION OF CROP PLANTS NOT PREVIOUSLY GENETICALLY MODIFIED ........................... 44 
5.1.2.  RISKS ASSOCIATED WITH POTENTIAL NOVEL TRAITS ........................................................................................... 45 
5.1.2.1. NOVEL TRAITS IN A SPECIES .......................................................................................................................... 45 
5.1.2.2. NOVEL TRAITS (SYNTHETIC BIOLOGY) ............................................................................................................. 46 
5.2. 
RISKS DUE TO UNINTENDED EFFECTS INHERENT IN NPBTS .................................................................................. 46 
5.2.1.  UNINTENDED EFFECTS ASSOCIATED WITH EFFECTOR PERSISTENCE ........................................................................ 46 
5.2.2.  RISKS ASSOCIATED WITH OFF-TARGET MODIFICATIONS AND UNINTENDED GENOME MODIFICATIONS ........................... 47 
5.2.3.  RISKS ASSOCIATED WITH COMBINING TARGETED MODIFICATIONS ........................................................................ 49 
5.3. 
RISKS ASSOCIATED WITH POTENTIAL ACCELERATION OF BREEDING OWING TO EFFICIENCY AND TECHNICAL EASE OF USE OF 
NPBTS  50 

 
 

6.  MANAGEMENT  MEASURES  REQUIRED  TO  PREVENT  AND  LIMIT  RISKS  TO 
HEALTH  AND  THE  ENVIRONMENT  ASSOCIATED  WITH  USE  OF  PRODUCTS 
OBTAINED BY NPBTS IF SUCH RISKS ARE IDENTIFIED (POINT 4 OF THE REFERRAL, 
IN CONNECTION WITH POINT 3) .................................................................... 51
 
7.  PROPOSAL OF INTERMEDIATE MEASURES BETWEEN THE PROVISIONS OF 
THE  EU  CATALOGUE  AND  THOSE  OF  DIRECTIVE  2001/18/EC  THAT  SEEM 
ADVISABLE  FOR  REGULATING  USE  OF  NPBTS  ON  EU  TERRITORY, 
INCORPORATING  ASSESSMENT  OF  THE  SOCIO-ECONOMIC  IMPLICATIONS  (IN 
CONNECTION WITH POINT 7). ....................................................................... 52
 
7.1. 
OUTLINE OF THE TWO SYSTEMS IN QUESTION .................................................................................................. 52 
7.1.1.  REGISTRATION IN THE OFFICIAL FRENCH CATALOGUE ........................................................................................ 52 
7.1.2.  EU SYSTEM SPECIFIC TO GM PLANTS ............................................................................................................. 52 
7.2. 
DISCUSSION OF INTERMEDIATE ARRANGEMENTS .............................................................................................. 53 
7.2.1.  CONCEPT OF DIFFERENCE/EQUIVALENCE LEAVING ASIDE THE TRAIT INTRODUCED .................................................... 53 
7.2.2.  PROCEDURES: A SYSTEM BASED ON CASE-BY-CASE APPRAISAL OF THE NEED FOR SPECIFIC ASSESSMENT ....................... 53 
7.3. 
PROPOSED ASSESSMENT METHODS ................................................................................................................ 56 
BIBLIOGRAPHY .............................................................................................. 58 
ANNEXE I SAISINE .......................................................................................... 65 
ANNEXE II LETTRE DE CADRAGE ..................................................................... 67 
ANNEXE III LISTE DES MEMBRES DU GROUPE DE TRAVAIL ............................. 71 
ANNEXE IV LISTE DES MEMBRES DU COMITE SCIENTIFIQUE .......................... 72 
APPENDIX V: INDIRECT AND NON-SPECIFIC RISKS .......................................... 75 
APPENDIX VI: GLOSSARY ............................................................................... 83 
 
 
 

 
 

Summary 
The abbreviation NPBT1 refers to any of a heterogeneous set of techniques for plant breeding. A key 
issue currently being debated in the European Union is the regulatory framework for these techniques, 
which are the focus of considerable interest in the agricultural sector. This raises multiple questions 
about environmental and health assessment of plants obtained by NPBTs as well as how they are to 
be detected, traced and, where applicable, labelled. 
The HCB Scientific Committee has drafted this opinion on the basis of a report by a working group2 and 
the discussions at the Scientific Committee’s four plenary sessions.3 Its remit4 was to provide answers 
to the questions in a referral from the Minister of the Environment and the Minister of  Agriculture 
relating to: 
•  Assessment and traceability methods for plants and products obtained by NPBTs;  
•  Implications for supply chain coexistence (in connection with the above point); 
•  Direct risks to health and the environment associated with novel characteristics of the plants 
and products obtained;5 
•  Management  measures  required  to  prevent  or  limit  risks  to  health  and  the  environment 
associated with use of plants and products obtained by NPBTs if such risks are identified; 
•  Proposals for intermediate options between the provisions of the EU catalogue and those of 
Directive 2001/18/EC that would seem advisable for regulating use of NPBTs on EU territory. 
 
Scope of the opinion 
In  its  opinion  the  HCB  Scientific  Committee  has  taken  account  of  all  the  NPBTs  currently  being 
discussed at EU level.6 It has also addressed related techniques such as TALENs7 and CRISPR/Cas98 and 
extended its discussion to all the uses of negative segregants as well as to RNA interference and the 
opportunity to modify several targets in one round allowed by some of these techniques. The opinion 
concerns use of NPBTs for plants of agricultural interest. 
 
                                                           
1 New plant breeding technique. 
2 See Appendix III. 
3 For convenience, the Scientific Committee has defined some of its terms in the glossary in Appendix VI. 
4 Following a decision by the HCB Board, see Appendix II. 
5 Thus the referral confined itself to asking HCB about direct and specific risks associated with NPBTs and the traits that they 
produce.  Risks  associated  with  characteristics  shared  with  plants  obtained  by  transgenesis,  random  mutagenesis  or 
traditional breeding methods are described in Appendix V to this opinion. 
6 Oligonucleotide-directed mutagenesis (ODM), zinc finger nucleases (ZFNs), cisgenesis, intragenesis, grafting of GM and non-
GM plants, agro-infiltration, epigenetic modifications using RNA-dependent DNA methylation (RdDM), and reverse breeding 
(list of techniques drawn up by the Netherlands in 2006: see fact sheets). 
7 Transcription activator-like effector nucleases. 
8 Clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9. 

 
 

Introduction to the opinion 
In its introduction to the opinion the Scientific Committee addresses the question of natural genetic 
variation  in  crop  plant  species.  The  Scientific  Committee  also  describes  the  type  of  mutations  that 
might be obtained, in particular using site-directed nuclease (SDN) techniques. This point is essential 
in order to characterise the mutations that can be obtained by some NPBTs, particularly SDNs, for the 
purpose  of  comparing  them  with  natural  mutations  and  considering  questions  of  detection, 
traceability, assessment and risk management for the varieties thus produced. 
The  Scientific  Committee  notes  that  mutations  obtained  by  SDN  techniques  are  defined  by  their 
genome  targeting.  It  observes  in  its  opinion  that  some  targeted  mutagenesis  techniques  may  be 
associated  with  unwanted  (off-target)  mutations  just  like  those  associated  with  conventional 
mutagenesis techniques or occurring naturally – mutations that could modify genome sequences that 
are still poorly characterised with regard to function. 
The opinion then considers the questions contained in the referral. 
 
Assessment and traceability methods for plant and products obtained by NPBTs 
The first question seeks to determine whether products obtained by NPBTs can be distinguished from 
products obtained using conventional crop breeding approaches.  
If  public  authorities  consider  establishing  coexistence  rules  and  molecular  traceability  for  products 
obtained  by  NPBTs,9  this  would  very  much  depend  on  the  ability  to  distinguish  those  obtained  by 
NPBTs. However, for some of these techniques, the modifications obtained are technically very difficult 
to identify.  
The  Scientific  Committee  has  determined  three  points  for  consideration  concerning  traceability  of 
plants obtained from various NPBTs: 
•  Detectability of a molecular characteristic in DNA (mutations: insertion, deletion, substitution, 
etc.), 
•  Identification  of  the  technique  underlying  the  molecular  characteristic:  if  a  molecular 
modification of DNA is found, can it be traced back to the technique used? 
•  Routine practical screening of food processing and production: given current screening tools, 
what would be the limitations in terms of detection and identification?  
Moreover,  the  existence  of  natural  variation  and  random  mutations  occurring  naturally  (see 
“Introduction to the opinion” above) may complicate the question of whether an NPBT has actually 
been used to breed the crop plant.  
The following ideas informed the discussion in the Scientific Committee: 
•  Without information about a modification, the Scientific Committee notes that, unlike the 
case of transgenic plants, for which molecular tools are used to detect certain transgenes, 
                                                           
9 Along the same lines as those for genetically modified plants (GMPs). 
 

 
 

it will be impossible to detect modifications in certain products obtained by NPBTs, such 
as those obtained by  SDN-1, SDN-2, ODM,  a few  SDN-3  techniques,10  RdDM,  grafting  a 
scion on GM plants, and negative segregants. 
•  Moreover, as in the case of transgenic plants, when detection of plants obtained by NPBTs 
is possible, whether in end products or at the various stages of production, the Scientific 
Committee notes that, depending on the complexity of mixtures, sampling bias combined 
with the technical limits of detection will affect the ability to detect some modifications. 
•  If molecular modifications are detectable and possibly quantifiable if the modified gene or 
sequence  is  known,  the  original  technique  used  to  obtain  the  modification  will 
nevertheless  be  very  hard  to  identify  solely  by  studying  the  product’s  DNA.  Breeder 
notification  of  the  technique,  together  with  availability  of  methods  to  identify  the 
modification, as is the rule for transgenic plants, would help to rectify this situation. 
•  However, even assuming this information to be available, detection could turn out to be 
impossible  in  the  following  cases:  some  types  of  grafting,  negative  segregants11,  and 
processing chains in which mixtures of products are used.  
•  Lastly, effectors12 are used for some NPBTs in the plant generation phases in a contained 
environment. Persistence of effector DNA fragments may generate plants that would then 
be  transgenic.  The  Scientific  Committee  notes  that  these  transgenic  plants,  which  are 
easily  identifiable  and  traceable  owing  to  their  transgenes,  will  be  subject  to  GMO 
requirements  for  contained  environments  and  will  subsequently  come  under 
Directive 2001/18/EC if these effectors remain in the plants or products of these plants 
placed on the market. The Scientific Committee has therefore chosen to focus on effector-
free plants that will be placed on the market. 
Thus:  
•  For techniques generating a detectable genetic modification but one that cannot be clearly 
attributed  to  an  NPBT,  the  Scientific  Committee  draws  a  distinction  between  a  case  in 
which precise information about the modification is available and a case in which there is 
no information about the modification: 
o  If precise information about the modification is supplied by the breeder: in this 
case  molecular  (DNA)  traceability  is  theoretically  possible  and  the  product, 
accompanied by information on the modification, can be identified molecularly13 
throughout the supply chain. However, for negative segregants and some cases of 
grafting it will still be technically difficult to identify modifications. Similarly, for 
modifications that can also be obtained by non-GM techniques, molecular assays 
alone cannot distinguish between the possible methods of obtaining the products. 
Only documentary traceability would allow this. 
                                                           
10 Mainly plants obtained by SDN-3 through cisgenesis. 
11 Non-transgenic offspring of a transgenic plant (see fact sheets). 
12 Effectors: Molecules (proteins or nucleic acids (RNA or DNA)) used to obtain the desired modification in the plant (see 
glossary, Appendix VI). 
13 Within the limits of  measurement and depending on the impact of industrial processing undergone by the plant. 
 

 
 

o  If there is no information about the modification: in this case, for SDN-1 and SDN-
2, ODM and RdDM,14 the HCB Scientific Committee has concluded that, without 
records,  traceability  will  often  be  very  complex  or  even  sometimes  impossible, 
since,  in  the  absence  of  precise  traceability  data,  molecular  methods  of 
characterising the end product cannot detect whether a product is obtained from 
a plant bred conventionally or by induced mutagenesis. 
o  For  DNA  insertion  (or  substitution)  techniques  (SDN-3,  cis-/intragenesis), 
detection methods similar to those used for GMOs could be introduced but might 
sometimes be complicated to interpret in the event of combinations such as SDN-
3 and cisgenesis, for example. 
 
Implications for supply chain coexistence (from farm to fork) 
In the event of a coexistence policy being introduced for one or more NPBT supply chains and other 
supply  chains  (conventional,  “GMO-free”,  organic,  etc.),  the  Scientific  Committee  asked  whether  it 
would  be  feasible  to  implement  it.  The  scenarios  set  out  by  the  Committee  reflect  the  options 
available. The choice of one or more of these options is a matter for the supply chains and the public 
authorities. 
The Scientific Committee has identified a number of scenarios, focusing on detection capabilities in 
commercial supply chains and their ability to coexist: 
•  Firstly,  for  supply  chains  interested  only  in  the  end  product,  regardless  of  breeding 
technique,15 whether the supply chain was defined in terms of inclusion or non-inclusion of 
products obtained by NPBTs would not necessarily be an issue.  
•  For supply chains interested in the plant breeding method, although molecular detection of 
plants modified by some NPBTs is not always  an option, documentary traceability could be 
introduced  to  help  regulate  crop  coexistence.  Specifications  could  be  proposed  for  these 
supply chains.  
•  Secondly, the Scientific Committee has come to the conclusion that if Directive 2001/18/EC 
were to be interpreted as excluding some NPBTs, new supply chains could be established in 
which the products’ molecular characteristics would be distinguished by using documentary 
traceability. 
•  If  Directive  2001/18/EC  were  to  be  interpreted  as  including  some  NPBTs,  the  Scientific 
Committee  believes  that  the  question  of  detection  would  then  become  critical  and  would 
depend  in  large  measure  on  technical  constraints,  especially  for  products  imported  from 
countries  using  NPBTs  or  for  detection  of  adventitious  presence  of  products  obtained  by 
NPBTs.16 
                                                           
14 Since some forms of RdDM do not require expression of a transgene. 
15 Although some traits such as herbicide tolerance may necessitate specific management measures. 
16 For example, regulatory thresholds for presence of products from plants obtained by NPBTs will affect detection capability, 
and, as explained previously, in some cases it would not be possible to determine which methods had been used. 

 
 

•  For cases in which a coexistence policy is to be established, and when genetic modifications 
can be detected, the Scientific Committee notes that coexistence measures could be based on 
the analysis provided in its opinion on coexistence. Such measures would apply particularly in 
the field. 
 
Direct risks to health and the environment associated with novel characteristics of products 
obtained 
In response to the referral’s question about risks, the Scientific Committee has focused on direct risks 
associated  with  novel  characteristics
  of  products  obtained  by  NPBTs,  whilst  listing  elsewhere 
(Appendix  V  of  the  opinion)  indirect  risks  and  risks  shared  with  other  breeding  methods  (GM  and 
conventional). 
The Scientific Committee has identified three categories of risk: 
•  Risks  associated  to  technique’s  unintended  effects  on  the  end  product  (e.g.  effector 
persistence and off-target modifications); 
•  Risks associated with ease of use of NPBTs, which could lead to a faster pace of production 
and faster cultivation of varieties obtained using these techniques; 
•  Risks associated with desired traits (novel traits, or new modifications of crop plants). 
 
Among  new  direct  risks,  the  Science  Committee  has  come  to  the  conclusion  that  the  main  risk  is 
associated  with  the  technically  avoidable  presence  of  effectors.17  The  Scientific  Committee 
recommends verifying that effectors are absent, which is technically possible. The Scientific Committee 
notes that effector persistence in a plant’s genome would make the plant transgenic. 
Other risks are associated with the techniques’ efficiency, speed, and the option of making several 
genetic modifications at once
 (multiplex genome editing) as well as the possibility of obtaining novel 
traits
18 : 

Acceleration  of  the  breeding  process  for  new  varieties  may  be  a  factor  in  agronomic 
improvement but can also hold risks. It will have an effect on farming production and food-
processing  systems,  whether  economically,  sociologically  or  ecologically.  It  is  therefore 
possible  that  it  will  positively  or  negatively  affect  ecosystem  functioning  and  dynamics, 
including ecosystem services that regulate the environment, since new balances may come 
into play. 

Moreover,  while  NPBTs  would  accelerate  adoption  of  the  new  varieties  obtained  by  these 
techniques,  having  an  impact  on  agricultural  ecosystems,  this  could  lead  to  additional 
adjustment  problems  for  biodiversity  and  associated  ecosystem  services.  These  problems 
                                                           
17 Effectors are the molecules (proteins or nucleic acids (RNA or DNA)) used to obtain the desired modification in the plant. 
18 A definition of novel traits can be found in the glossary in Appendix VI. 

 
 

would  be  compounded  if  these  genetic  modifications  spread  into  wild  species  sexually 
compatible with the crop varieties. 

As for risks associated with desired novel traits, the Scientific Committee defines a Novel Trait 
as the introduction into a variety of an entirely new trait not  already present in the species 
itself  and/or  a  related  species.19  In  this  case,  the  Scientific  Committee  cannot  identify  any 
specific  risks,  since,  by  definition,  these  traits  have not  yet  been  described
.  The  Scientific 
Committee therefore recommends case-by-case assessment taking account of the trait itself 
and the species into which it has been introduced (see below). In this connection, the Scientific 
Committee has discussed the likelihood of unanticipated ecological effects, which might be 
greater in the case of Novel Traits drastically modifying a plant’s metabolism. 

Lastly, the Scientific Committee has addressed the issue of off-target genome modifications 
using  directed  approaches  (SDNs  and  ODM).  A  mutation  outside  the  target  region  could  in 
some  cases  have  an  unintended  effect on the  plant’s  phenotype.  The  Scientific  Committee 
notes that technical developments are leading to a substantial reduction in these off-target 
modifications. It further notes that off-target modifications are also found with other widely 
used unregulated techniques. The latter also induce mutations outside the sites selected. The 
Scientific Committee adds that off-target mutations20 with unwanted phenotypic effects could 
be  removed by  backcrossing  in the case of  annuals. Nevertheless,  the  Scientific  Committee 
notes that this might be difficult or even impossible to do for some perennials or plants that 
reproduce  mainly  through  vegetative  propagation.  In  this  case,  additional  molecular  data 
might be requested on a case-by-case basis. 
 
Management measures required to prevent or limit risks to health and the environment 
associated with use of products obtained by NPBTs if such risks are identified 
If  risk management measures  were  to  be  required, the  Scientific  Committee  suggests  that  they  be 
introduced in the light of the results of an assessment conducted on the basis of the proposals set out 
below.21 
For risks associated with presence of effectors 
Plants in which effectors are still present are transgenic plants. Directive 2001/18/EC lays down that 
such  plants  shall  be  subject  to  assessment  and  appropriate  management  measures  (including 
surveillance and post-market monitoring). 
For risks associated with off-target modifications 
                                                           
19 By way of example, a herbicide tolerance trait already obtained in the same species by other methods is not a novel trait. 
In this particular case there is room for cross-cutting discussion of the ways in which herbicides are used, regardless of the 
technique employed. 
20 This applies to all unwanted mutations appearing during breeding of conventional varieties or in plants obtained by NPBTs, 
including when the technique is used on a plant that has already been modified by an NPBT. 
21 See Section 7 of the opinion. 

 
 

More generally, the Scientific Committee notes that breeders carry out a number of backcrosses when 
introducing  a  trait  into  a  variety,  and  this  should  enable  the  risks  associated  with  off-target 
modifications to be reduced significantly. If an unwanted effect associated with an off-target mutation 
is found, the Scientific Committee recommends backcrossing to remove it from the plant to be placed 
on the market. 
For novel traits as defined in the opinion 
An assessment  should be carried out  in the case of plants  having a  genuinely novel  character.  This 
assessment  would  depend  on  the  trait  introduced.  Once  the  dossier  had  been  considered,  the 
assessment could be conducted, depending on the traits and the species, in a contained environment 
(in vitro or in a mesocosm to study the effects on ecological interactions and biodiversity22 in particular) 
and/or in field trials. 
For risks associated with faster breeding 
Local management with, if necessary, gradual roll-out over time and space of plants with a Novel Trait 
should be suggested to control the pace of agro-ecosystem change that might result from use of these 
plants, especially with regard to dispersal in sexually compatible, related wild species. 
For biomonitoring the Scientific Committee proposes the following management measures: 
To limit any other risks  not  immediately identifiable,  the  Scientific Committee suggests  introducing 
biomonitoring for Novel Traits (including those obtained by multiplex genome editing). This monitoring 
will make it possible to gain knowledge about the behaviour of these varieties when they are widely 
placed on the market at multi-year intervals and particularly about effects on biodiversity. The current 
biomonitoring  system  and  networks  for  monitoring  farming  practice  should  be  adapted  to  these 
requirements. After a period to be defined, and depending on the observations made, an assessment 
should be made as to whether the biomonitoring should be continued. 
Lastly, the Scientific Committee stresses the need for long-term conservation and management of gene 
pools for each species that have not been modified by NPBTs.23  
 
Proposals for intermediate options between the provisions of the EU catalogue and those of 
Directive 2001/18/EC 
After outlining existing arrangements (Directive 2001/18/EC, requiring risk assessment for GMPs, and 
registration in the official catalogue, requiring assessment of varieties’ value for cultivation, use and 
the environment), the Scientific Committee has considered possible intermediate options.  
Subject to approval by public policymakers, the Scientific Committee suggests that breeders should 
provide the competent authorities with a dossier containing molecular and phenotypic data on each 
of their products.24 Depending on the modification introduced and taking into consideration its history 
                                                           
22 See Appendix VI. 
23 Biological resources centres will have to take account of development of varieties obtained by NPBTs. 
24 See molecular data required in Scientific Committee opinion. 
 
10 
 
 

of  use,25  the  categorisation  procedure  might  entail  assessment  for  GMOs  not  exempt  from 
assessment,26 a new form of intermediate assessment, or exemption from specific assessment (as in 
the case of exempted GMOs and conventional breeding).27 These options would make it possible to 
adapt the information requested and the assessments made to the technique used, the trait conferred 
on the plant, etc. Bodies such as the CTPS,28 ANSES,29 the InVS30 and HCB could participate at national 
level in this categorisation procedure (which should be consistent with decisions taken at EU level). 
Regardless of the current stage of development of NPBTs, the Scientific Committee believes that it is 
not just the techniques in themselves that should determine the assessment system, unless they result 
in GMOs within the meaning of Directive 2001/18/EC. For techniques producing plants and products 
that  cannot  be  distinguished  from  others  obtained  by  different  methods,  some  of  which  may  be 
unregulated,  the  Scientific  Committee  recommends  assessment  of  these  plants  and  products  with 
reference to their traits, and particularly the novelty of these traits.  
 
                                                           
25 If the phenotype exists and is used in agriculture. 
26 As provided for in Directive 2001/18/EC. 
27 The Scientific Committee notes, however, that assessment by the Technical Committee for Plant Breeding (CTPS) followed 
by registration in the French Official Catalogue are a prerequisite for placing the variety on the market. 
28 Technical Committee for Plant Breeding. 
29 French Agency for Food, Environmental and Occupational Health and Safety. 
30 French Health Monitoring Institute (now part of Public Health France). 
11 
 
 

1.  Introduction 
1.1. Background 
On 22 February 2016 the High Council for Biotechnology was asked for an opinion by Ségolène Royal, 
Minister of the Environment, Energy and Marine Affairs, and Stéphane le Foll, Minister of Agriculture, 
the  Food Processing  Industry  and  Forestry,  on  the  issue of  new  plant  breeding  techniques  (NPBTs) 
(Appendix  I).  The  HCB  Board  accordingly  drafted  a  letter  with  guidelines  for  its  two  committees 
(Appendix  II).  An  ad  hoc  working  group  (WG),  whose  composition  was  approved  by  the  Board  on 
proposals  from  the  HCB  President,  the  Scientific  Committee  and  the  Secretariat,  was  set  up  (WG 
composition in Appendix III). After meeting four times, the working group delivered a report intended 
to provide background for Scientific Committee discussions. The report was considered at the Scientific 
Committee meeting of 13 July 2016 and formed the basis of discussion at the Scientific Committee 
meetings on 13 July, 21 September, 27 October and 23 November 2016, which resulted in the drafting 
of this scientific opinion by the Scientific Committee. 
Before we turn to the work process and the substance of the issues raised, the following points should 
be noted. 
The  HCB  Scientific  Committee’s  role  is  to  clarify  the  scientific  aspects  of  the  issue  referred  for  an 
opinion, together with regulatory and legislative options that are a matter of policy choice. 
The Committee’s scientific opinion is combined with the recommendation from the Economic, Ethical 
and Social Committee (EESC) to constitute the HCB opinion. 
When reading the assessment below it must be borne in mind that the HCB Scientific Committee has 
worked on a referral concerned almost exclusively with identification of the risks associated with use 
of  these  new  plant  breeding  techniques  (NPBTs).  For  the  purposes  of  an  informed  decision  about 
cultivation  of  plants  obtained  by  these  techniques,  this  evaluation  has  also  had  to  take  into 
consideration  scientific  and  agronomic  advances  throughout  the  value  chain  and  the  benefits  that 
might emerge from the production of plants obtained by NPBTs.  
It is important to note that this scientific opinion applies to cultivated varieties of plants of agricultural 
interest.  Consequently,  NPBTs  are  here  discussed  with  regard  to  breeding  of  cultivated  varieties 
rather  than  modification  of  wild  species
.  This  opinion  concerns  use  of  these  techniques  to  breed 
plants  of  agricultural  interest  that  will  be  grown  beyond  research  laboratories.  The  HCB  Scientific 
Committee  thus  notes  that  this  opinion  relates  to  plants  that  could  be  grown  in  the  open  field.31 
Intermediate plants not intended for registration in the French Official Catalogue of Plant Varieties and 
grown in the laboratory for research purposes or in containment greenhouses are not covered by this 
opinion. Modification of plants in the laboratory is subject to specific monitoring and reporting under 
the rules governing research and development work.  
 
                                                           
31 For laboratory cultivation, French regulations (Decree No. 2011-1177 of 23 September 2011 on contained use 
of genetically modified organisms) require reporting of manipulations and appropriate containment of modified 
organisms. 
12 
 
 

The Scientific Committee notes that all agronomic practices, particularly those altering crop area or 
entailing use of natural or synthetic molecules, influence development of the biotopes populated by 
wild species. 
 
1.2. Work process 
This scientific opinion has been drafted to reflect discussion in the Scientific Committee’s meetings.32 
The initial draft opinion was presented by the Secretariat on the basis of the working group’s report. 
The discussion that took place in the meetings, including any points of contention, is reflected in the 
relevant  sections.  The  Scientific  Committee  has  also  updated  the  fact  sheets  on  all  the  techniques 
discussed that were appended to the Scientific Committee's interim report on NPBTs. This scientific 
opinion is structured according to the order of the questions sent to the Scientific Committee in the 
referral.  
 
1.3. State of the art and questions concerning mutations and natural variation33 
The rapid expansion in new plant technology, with design and use of new plant breeding techniques 
(NPBTs), raises a number of questions. The current NPBT debate in Europe hinges on the regulatory 
framework for products obtained by use of “new” genetic breeding methods, since there is doubt as 
to whether they come under the GMO directives.34 It is important, even critical, to settle this question 
if  these  techniques  are  going  to  be  adopted.  It  is  also  important  for  terms  and  descriptions  to  be 
clarified for all concerned, including supply chains and consumers. 
It  should  be  noted  that,  because  of  the  subject’s  history,35  the  list  of  techniques  discussed  is 
heterogeneous36  and  the  generic  term  “new  plant  breeding  techniques  (NPBTs)”  may  give  rise  to 
confusion. Thus: 
                                                           
32 On 13 July, 21 September, 27 October and 23 November 2016. 
33 This section provides some basic information on molecular genetics. It should be borne in mind that, as in the 
rest of the opinion, the proposals it contains are restricted to crop plants. 
34 The EU directives on GMO use are (1) Directive 2001/18/EC on the deliberate release into the environment of 
genetically modified organisms, and (2) Directive 2009/41/EC on the contained use of genetically modified micro-
organisms. 
35 Initial report by COGEM in 2006, followed by establishment of a European Commission working group and 
publication in a journal with a high impact factor (Nature Biotechnology) of the findings of a parallel investigation 
by the Commission’s Joint Research Centre (Lusser et al., 2012).  
36 List of NPBTs discussed by the European Commission working group: oligonucleotide-directed mutagenesis 
(ODM), zinc finger nuclease (ZFN) technology, cisgenesis (including intragenesis), grafting, agro-infiltration, RNA-
dependent DNA methylation (RdDM), reverse breeding, and synthetic genomics. The reader is referred to the 
fact sheets describing these techniques. 
 
13 
 
 

While they all apply to plant breeding, the techniques considered are not necessarily specific 
to the  plant  kingdom:  site-directed nucleases  (SDNs)  and genome editing, for example,  are 
also frequently used for animals and in medicine; 
These techniques are not necessarily new: grafting is an old technique, but the question arises 
of whether products obtained by grafting a non-genetically modified (non-GM) scion onto a 
genetically modified (GM) rootstock should be regarded as genetically modified; 
o  Some  items  on  the  list  are  not  techniques  as  such  but  entail  use  of  genetic 
engineering:  innovative  plant-breeding  strategies  (such  as  reverse  breeding),  for 
example. This then raises the question of their status under the regulations (the case 
of negative segregants); 
o  Further complexity comes from the fact that it is possible to have combinations of 
NPBTs (targeted cisgenesis with SDN-3 technology, for example). 
Taking the NPBTs under discussion in the European Commission as its basis, this opinion concerns the 
following:37  
i)  Genome-targeting NPBTs 
(a)  Site-directed nucleases (SDNs:38 ZFN,39 MN,40 TALEN,41 CRISPR42/Cas9
(b)  Oligonucleotide-directed mutagenesis (ODM,43 RTDS,44 etc.) 
ii)  Epigenetic techniques 
(a)  Gene expression control by RdDM45  
iii)  Factors related to use of genetic engineering techniques 
(a)  Specific contexts in which genetic engineering techniques are used 
1.  Agro-infiltration 
2.  Grafting of a non-GM scion onto a GM rootstock or a GM scion onto a 
non-GM rootstock 
(b)  New concepts associated with the nature of the modified sequence 
                                                           
37 Techniques covered by individual fact sheets are shown in bold type. An additional fact sheet is devoted to 
‘conventional’ transgenesis for comparison purposes. 
38 SDNs: Site-directed nucleases. 
39 ZFN: Zinc finger nuclease. 
40 Meganucleases (MNs) are not covered by a fact sheet in the appendix because the working group considered 
the technology to have been overtaken already by other targeting tools. 
41 TALEN: Transcription activator-like effector nuclease. 
42 CRISPR: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats. 
43 ODM: Oligonucleotide-directed mutagenesis. 
44 RTDS: Rapid Trait Development System. 
45 RdDM: RNA-dependent DNA methylation. 
 
14 
 
 

Cisgenesis / Intragenesis 
iv)  Offspring  of  modified  individuals  in  which  genetic  modification  has  been  removed  by 
segregation 
(a)  Negative  segregants,  produced  through  innovative  breeding  strategies  (e.g. 
reverse  breeding,  various  accelerated  breeding  methods,  Seed  Production 
Technology, etc.) 
The question may arise as to the novelty of the traits conferred by these techniques. The Scientific 
Committee draws a distinction between two types of novelty:  

Introduction  into  a  variety  of  a  trait  identified  in  another  variety or  another  related or 
sexually compatible species: the idea is to enhance existing genetic diversity by introducing 
allelic states of interest. Consequently there is no addition46 of genetic sequences or any 
modification of the function of the genes already present in the plant. This will be called 
a “novel trait in the variety or species”


Introduction of an entirely new trait into a variety and/or related species:47 the novel trait 
stems from the fact that the gene has not been identified in the species in question or the 
modification  of  a  gene  already  present  introduces  a  new  metabolic  pathway  or  new 
function into the species. This will be called a “Novel Trait” in this opinion. 
1.3.1.  General characterisation of NPBTs 
•  Genome-targeting NPBTs 
 
Molecular targeting of the genomic site for genetic modification is a key feature of a number of these 
new techniques (SDNs: ZFN, MN, TALEN and CRISPR/Cas9 (see the Scientific Committee interim report 
and the fact sheets on the HCB website)
Site-directed nucleases can be used to target selected DNA sequences for three purposes:  
(1)  Random mutation (insertion or deletion) of a single base pair or a small number of nucleotides 
(one to several dozen) although targeted at a specific site on the genome, known as SDN-1;  
(2)  Allele conversion, modifying part or all of a gene sequence, known as SDN-2;  
(3)  Targeted integration of a DNA sequence, known as SDN-3.  
The diagram below shows how some of these techniques fit in with the existing landscape (Figure 1): 
                                                           
46  It  is  important  to  clarify  the  concept  of  addition  for  cisgenesis  and  intragenesis.  Genetic  material  may  be 
introduced, but the genes inserted already exist in the species in a different allelic state or are present in certain 
varieties of the same species. 
47 This distinction is highlighted in Canada’s GMO rules, which provide for assessment only in the case of varieties 
having a new trait not previously present in the variety or related species (http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/gmf-
agm/index-eng.php)

 
15 
 
 


 
Figure 1. NPBTs: SDN-1 differs from conventional mutagenesis in that it targets a specific site on the genome, usually, but not 
automatically, leading to loss of function in the gene targeted (gene knockout). Nucleases are introduced into the cell to 
target a mutation site, but the nature of the mutation is not predefined. With SDN-2, a DNA template is introduced into the 
cell together with the site-directed nucleases, enabling the nature of the modification to be defined. The template itself is 
not incorporated into the genome. The same purpose can be achieved using oligonucleotide-directed mutagenesis (ODM, 
RTDS). SDN-3 allows targeted integration of a sequence. It is this targeting of the transgene insertion site that distinguishes 
the latter technique from conventional transgenesis. 
 
•  Epigenetic techniques 
RNA-dependent DNA methylation (RdDM) uses epigenetic changes48 to control (increase or reduce) 
expression of a given plant gene without altering its nucleotide sequence. This can cause variations in 
metabolic activity, for example. It is also possible to control gene expression in an organism interacting 
with the plant, enabling pathogens (for example) to be targeted. The Scientific Committee notes that 
new  approaches  are  possible  and  that  these  epigenetic  modifications  can  be  achieved  through 
expression  or  transient/stable  transfer  of  a  transgene  or  specific  proteins  (e.g.  through  agro-
infiltration, CRISPR with a fusion protein having methyltransferase activity (Cas9-MT), or modification 
induced by a transient viral infection (VIGS)). With  transient transfer,49  the  epigenetic  alteration of 
gene expression control can be inherited over several generations. 
•  Other techniques 
The other techniques are in fact methods: “non-propagative” agro-infiltration, grafting of genetically 
engineered plants, cisgenesis/intragenesis, and, for innovative selection strategies, removal of genetic 
material by segregation through conventional crossing (negative segregants), the status of which has 
to be clarified. 
 
                                                           
48 Epigenetics describes the  molecular mechanisms controlling expression of a genetically encoded trait. This 
opinion  discusses  modifications  obtained  by  DNA  methylation.  Such  DNA  modifications  are  reversible,  and, 
although they can be inherited between generations, whether they are retained will depend on the environment. 
Other modifications of DNA-associated proteins are possible. 
49 Longer-lasting expression is possible using transgenesis or SDN-3 targeted insertion for introduction into the 
genome.  The  non-permanent  nature  of  the  modification  is  again  apparent  if  the  transgene  is  removed  by 
segregation. 
16 
 
 

1.3.2.  Questions raised by NPBTs 
In the following section, some experts wanted to contextualise the concepts of mutation and variation. 
One  expert  wanted  the  type  of  mutations  observed  to  be  addressed.  Thus  the  discussion  bore  on 
whether or not mutations not found in nature could be obtained by using NPBTs. The question of the 
emergence and retention of these mutations was raised and gave rise to the paragraphs below (section 
1.4).
 
 
With regard to the current EU regulatory framework on GMOs, questions about the status of the above 
NPBTs  chiefly  concern  their  similarity  to  techniques  that  come  under  the  existing  rules  (mainly 
Directive  2001/18/EC).  The  European  Commission  is  expected  to  rule  on  whether  or  not  these 
techniques are considered to generate GMOs as defined by Directive 2001/18/EC and whether they 
should be regulated as such or be exempt from assessment.  
At  present  a  product  has  GMO  status  when  obtained  by  techniques  involving  insertion  of  new 
molecules of recombinant DNA. 
The regulations cover induced mutation. Products of mutagenesis 
are exempt from assessment owing to a history of safe use. 
The targeting capability of some NPBTS with regard to genome modifications could be put forward as 
an argument for easing the regulations concerning assessment requirements. 
Multiplex genome editing capability, i.e. carrying out several genome modifications in a single stage 
principally in order to obtain a Novel Trait must also be taken into account. 
The question of a modification’s transmission and heritability should also be considered:  
(1) Transient presence (of short duration, from a few hours to a few days, in a cell and not inherited) 
as opposed to heritability of the genetic modification. This also covers modification of somatic cells as 
opposed to germ cells (modification of somatic cells can also be inherited by vegetative propagation);  
(2)  Transient  presence  as  opposed  to  heritability  of  the  epigenetic  consequences  of  a  genetic 
modification (epigenetic changes can be induced without stable insertion of genetic material in the 
genome; with stable insertion, however, they can be inherited after elimination of the inducing gene 
by segregation); 
(3)  Transient  presence  as  opposed  to  heritability  of  the  recombinant  DNA  needed  to  obtain  the 
mutation. 
Another  set  of  questions  concerns  detection  of  products  obtained  by  a  particular  technique.  If 
molecular detection technology is unable to tell the difference between the techniques used to obtain 
products, non-DNA traceability methods (technical or administrative traceability) could provide some 
information. 
There is also the question of management methods for potential risks. Where they exist, risks specific 
to  NPBTs  will  have  to  be  identified  and  appropriate  and  proportionate  management  methods 
suggested. 
As noted above, EU legislation is being debated against a background of continuously evolving genetic 
engineering techniques. The question of the need for assessment arises, particularly if one organism 
cannot be distinguished from another obtained by practices not subject to assessment. 
17 
 
 

1.4. Considerations regarding natural genetic variation in a plant species 
For products obtained by NPBTs there is the question of differences between natural variability and 
variability obtained by these techniques. It is imperative to define the concept of variability in order to 
understand  how  to  assess  the  risks  and  benefits  associated  with  both  conventional  and  new 
techniques. 
Variability is relevant to addressing the issues of assessment:  

In terms of risk, are molecular changes induced by NPBTs qualitatively and/or quantitatively 
different  from  those  resulting  from  natural  variation  or  conventional  plant  breeding 
techniques? 

In  terms  of  identification/detection,  how  can  events  associated  with  use  of  NPBTs  be 
distinguished from natural variation or conventional breeding? 

Both these questions also arise for presence of additional (off-target) mutations. 
 
1.4.1.  Origin of genetic variations 
In biology, genetic transmission of traits between generations is based on transmission of the genome 
(nuclear  and  cytoplasmic).  The  genome’s  primary  structure,  i.e.  the  sequence  of  nucleotides 
constituting the DNA molecule, is the carrier. Epigenetic changes, which modify the chemical structure 
of the nucleotides (or chromatin) but not their sequence, influence genome expression. 
Genomes are susceptible to modification, ranging from change in a base pair up to major modifications 
such  as  deletion,  duplication,  insertion  of  large  DNA  fragments  or  chromosomal  rearrangements, 
which  affect  the  genome’s  primary  structure.  These  modifications  can  result  from  DNA 
replication/repair  errors,  action  of  transposable  elements,  or  chromosomal  recombination  events 
related to sexual reproduction.  
This  phenomenon  of  natural  modification  of  the  genome  is  universal  and  to  be  found  in  all  living 
organisms  (plants,  animals  and  microorganisms)  at  a  rate  that  depends  on  the  organism  (e.g.  one 
mutation for approximately 100 million base pairs per generation in Thale cress, Arabidopsis thaliana 
(Lynch,  2010)).  Consequently,  for  a  plant  with  a  small  genome  such  as  Arabidopsis  thaliana,  the 
genome of each new seed contains one mutation on average compared with the genome of the seed 
that generated it (Ossowski et al., 2010). Applying linear extrapolation to a genome 120 times larger, 
such as that of  wheat,  the figure  would be  roughly  120 mutations per seed.  In a  hectare of wheat 
containing around one million plants, study of the genomes of all the seeds harvested would therefore 
show at least 120 million mutations  compared with the genomes of the seeds sown originally. The 
upshot  of  this  theoretical  calculation  is  that,  statistically  speaking,  in  all  the  genomes  of  the  grain 
population  harvested  in  a  hectare  of  wheat,  every  gene  would  contain  one  mutation  in  its  DNA 
sequence by comparison with the grain sown. 
In  other  words,  by  growing  a  hectare  of  wheat,  a  farmer  could,  statistically  speaking,  obtain  one 
mutation  in  each  wheat  gene  (in  reality the  distribution of these  mutations  is  uneven  (see  Section 
1.4.3)). 
18 
 
 

A large proportion of these changes cannot be linked to or correlated with phenotypic variations with 
a measurable impact on the organism or the ecology of the population to which the organism belongs. 
At present most of these mutations are thus described as “silent”, either because they actually are, or 
because our current methods of observation do not show their effects. 
For wheat, and all crop varieties in general, if the harvest is consumed in its entirety these mutations 
cannot be expressed in offspring. If part of the harvest is resown or used for breeding purposes, some 
of the mutations will therefore be present in the progeny. Mutations affecting the phenotype (“non-
silent” mutations), if not lethal, will usually not persist in the progeny unless they are selected and 
offer a trait sought by the breeder. “Silent” mutations (i.e. mutations not affecting the phenotype) will 
evolve in the same way as mutations in non-crop plants, which are described in the following section. 
This argument concerning occurrence of natural mutations in wheat applies to all living organisms. The 
DNA base sequence is susceptible to mutation, and the gene pool of every species50 contains a large 
number  of  variations,  some  of  which  are  silent  whilst  others  are  not.  These  mutations  are  either 
present in the gametes and therefore transmitted to offspring or else present in the genome of somatic 
cells and thus not transmitted. 
Similarly, work on epigenetic modifications (DNA methylation, modification of associated histones) has 
shown that transmissible epigenetic changes can exist that are subject to variation within populations.  
 
1.4.2.  Fate of genetic variations: natural evolution (no human intervention) 
The  only  potential  limit to  the  number of  genetic  variations  is  the  rate  of  natural  mutation.  But  in 
reality, in a given environment, variation in natural populations is the result of a balance between (1) 
processes  that  tend  to  increase  variation  (mutation  and,  similarly,  migration  between  different 
populations), and (2) processes that tend to reduce variation: genetic drift (accumulation of variations 
being limited by finite population size) and natural selection.  
The silent mutations appearing in non-coding, non-regulatory regions, and those appearing in coding 
regions (which do not induce amino acid substitutions and therefore changes in the protein sequence 
encoded by these genes), are considered to be “neutral”: they do not alter the phenotype and are not 
affected by natural selection. According to the neutral theory (Kimura, 1984), genetic diversity, defined 
as  the  proportion  of  variable  sites  between  two  randomly  selected  sequences  in  a  population,  is 
explained by mutation rate and population size. It is generally between 0.01% and 5% (Gouesnard et 
al., 2005).  
 
1.4.3.  Characteristics of variation within genomes 
Coding  sequences  and  regulatory  non-coding  sequences  have  a  rate  of  change  that  is  on  average 
slower  than  that  of  non-coding  sequences  (since  negative  selection  predominates),  and  their 
                                                           
50 Two individual human beings are set apart from each other by some three million genetic variations, and up 
to 1500 somatic mutations per cell are found in a single individual (Science, 25 September 2015, Vol. 349, Issue 
6255).  
19 
 
 

arrangement in the genome is stable within a species. Conversely, non-coding sequences, which do 
not control gene expression and are in the majority (up to 98% of the genome in maize, for example), 
change at rates that are much higher on average, and they often contain transposable elements. 
As for coding sequences, the degree of variation changes from one gene to the next and is influenced 
by gene function and natural  selection.  The  latter  depends on  variation  in the overall environment 
and/or  the  gene  environment  in  the  genome.  Recombination  constantly  produces  new  gene 
combinations  and  therefore  new  phenotypic  variations  (most  traits  are  multigenic:  their  value  is 
determined by combination of a number of genes). 
 
1.4.4.  Intra- and interspecies variation 
Genetic variation among individuals and populations of the same species is usually less than genetic 
differences between species. Nevertheless, species are not independent, or even necessarily separate 
entities.  Closely  related  species  (having  diverged  recently  on  the  evolutionary  time  scale)  share  a 
proportion of the variations inherited from their ancestral species. Moreover, hybridisation between 
different  plant  species  is  possible,  with  new  variations  thus  being  exchanged  between  species. 
However, this is still uncommon between crops and wild species (Andersson and de Vicente, 2010; 
Dempewolf et al., 2012).51  
 
1.4.5.  Human selection and crop evolution 
Genetic variation through continually occurring natural change in the genome is the basis for evolution 
of organisms. It is also on this genetic variation within and between species that plant breeders rely to 
improve their plants.  
Finding the  best  combination of traits for a particular species and given environment has been the 
main concern of plant and animal domestication and breeding for over 10,000 years. The huge number 
of  combinations  producing  genetic  variation  through  natural  mutagenesis  offers  many  breeding 
options, but this is also a problem, since it may be necessary to eliminate variations that counteract 
the effects of selection. Advances in plant genomics (Kole et al., 2015) might perhaps, in years to come, 
constitute an alternative, a complement to NPBTs or a factor in combination. 
One member of the Scientific Committee wished  to add that  the  distribution  of targeted  mutations 
differs from that of natural mutations on at least three counts.  

o  Location on the genome, 
o  Type of mutation depending on SDN technique (proportion of insertions, deletions 
and substitutions, and their outcomes in terms of silent or non-silent mutations);  
o  Their adaptive value for cultivation escapes, or related species, sexually compatible 
with the cultivated variety obtained by an NPBT. 
                                                           
51 Although it is less unusual between wild plants (Whitney et al., 2010)  
20 
 
 

The  distribution  of  mutations  obtained  by  conventional  mutagenesis  is  itself  different  from  that  of 
targeted mutations and natural mutations.  

 
 
1.4.6.  Targeted mutations, off-target mutations and natural variation 
The changes induced by SDN techniques are derived from a double-stranded break in DNA. 
- In the case of SDN-1, the plants selected show a targeted mutation, mainly in the form of 
micro-deletions  or  micro-insertions,  and  these  changes  are  usually  associated  with  gene  silencing. 
Natural variants of the silenced gene have greater molecular diversity. These mutations include not 
only  micro-deletions  and  micro-insertions  but  also  substitutions,  translocations  and  other 
rearrangements. 
- In the case of SDN-2 and ODM, the mutations introduced reproduce variations observed as 
part of genetic diversity, which have been selected to be associated with a phenotype of agricultural 
interest. In most cases, the same phenotype can be obtained from different mutations. 
Thus, for a given gene, the mutations from SDN-1, SDN-2 or ODM may or may not be identical to those 
found in cultivated varieties. 
 
A member of the Scientific Committee raised the issue of the characteristics of off-target mutations 
for SDNs. The issue related to the fact that they could differ from mutations found in the absence of 
manipulation  and  could  affect  regions  of  the  genome  with  little  natural  variation,  particularly 
uncharacterised regions. The Scientific Committee notes that, as explained elsewhere in the opinion, 
off-target mutations have the following characteristics: 

They are  found  in  sequences  similar  to the target sequences  (1 to 5 nucleotide  differences 
depending  on  the  technique).  They  are  therefore  computationally  predictable  in  known 
genomes,  or  can  be  identified  by  sequencing  modified  cells  or  using  dedicated  techniques 
(involving some degree of complexity). 

The biochemistry of off-target mutations is the same as that of natural variations. Since SDNs 
produce double-stranded breaks in DNA, physiological repair systems are called into play. 
o  The fact that there is little variation in some regions of the genome is accounted for 
by  the functional  importance of these  regions (negative selection  pressure). Effects 
due  to  off-target  mutations  in  these  regions  would  therefore  in  all  likelihood  be 
associated with a phenotype that the breeder could choose whether or not to keep. 
o  Some  types  of  mutation  at  given  sites  (for  example,  variations  in  the  number  of 
repetitions  in  repeated  regions)  are  influenced  by  the  mechanisms  involved  in 
producing  these  mutations  but  are  not  indicative  of  any  particular  risks.  An  SDN-
induced  break  in  these  regions  would  therefore  have  the  same  consequences  as  a 
natural break followed by physiological repair. 

For  SDN-2  and  SDN-3  the  consequence  of  an  off-target  mutation  will very  probably  be  the 
same as for SDN-1, since the probability for the template DNA to recombine in the area of the 
21 
 
 

DNA  break  is  very  small.  This  also  applies  to  off-target  mutations  found  in  ODM,  where 
sequence homology is necessary for oligonucleotides to work. 
 
2.  Definition of terms and techniques 
To comprehend the issues discussed in this opinion, it is essential to understand the techniques. The 
Scientific Committee has therefore produced a set of fact sheets.52 
These fact sheets have been updated with additional information from the working group and from 
the Scientific Committee’s meetings. For each technique they give a cellular and molecular description, 
practical  details,  possible  uses,  pros  and  cons  in  relation  to  existing  techniques,  detection  and 
traceability  methods,  developmental  stages  and  additional  background  information.  They  can  be 
found in Appendix VII of this document. 
For reasons of consistency the HCB Scientific Committee has chosen to give certain terms that might 
be used in other contexts a specific meaning that is explained in the glossary in Appendix VI. To avoid 
any  confusion,  the  Scientific  Committee  would  like  to  clarify  that  this  glossary  applies  only  to  this 
opinion. 
 
2.1. Multiplex  genome  editing  and  simultaneous  production  of  multiple  site-specific 
modifications 
SDN techniques can be used to make more than one modification to the genome at the same time. 
 
At one locus  
With  SDN-2,  use  of  a  “repair  template”  containing  a  combination  of  several 
mutations/insertions/deletions at the same locus can produce a plant that it would be very difficult or 
even  statistically  impossible  to  obtain  by  random mutagenesis  or  selection  of  natural  mutations.  It 
should be noted that several mutations can occur naturally at a given locus. Multiplex genome editing 
also  enables  modifications  to  be  traced.53  Apart  from  this,  such  editing  could  have  the  benefit  of 
modifying  the  function of a  gene:  this would then  be  a  Novel  Trait.  Similarly,  the  SDN-3  technique 
allows insertion of more than one transgene at just one locus. All these transgenes will be transmitted 
to offspring as a single locus. 
 
At multiple loci 
SDN  techniques  can  be  applied  simultaneously  to  multiple  regions  of  the  genome  by  introducing 
multiple nucleases and/or guide RNAs and multiple repair templates (Raitskin and Patron, 2016). It is 
thus possible to obtain controlled genetic modifications of multiple genes or sequences. For example, 
                                                           
52  These  fact  sheets  have  been  updated  with  additional  information  from  the  working  group  and  from  the 
Scientific Committee’s meetings. 
53 Traceability through combination of a specific DNA sequence without changing the encoded protein sequence. 
 
22 
 
 

this  would  allow  simultaneous  silencing  of  a  gene’s  different  alleles  in  polyploid  plants  (such  as 
hexaploid wheat) (Wang et al., 2014), targeting of gene families, and modification of genes involved in 
the same metabolic pathway.  
It would also be possible in theory to obtain novel products54 by modifying a series of genes or through 
mutagenesis of a gene to change its function.  
It is important to note at the moment and in the near future that 1) the ability to deliver SDN effectors 
easily (whether for SDN-1, -2 or -3) is a significant limitation on multiplex genome editing capability, 
and 2) creation of new functions falls mainly within the sphere of research. 
 
2.2. Boundaries between SDN-1, -2 and -3 
Classification  of  the  various  genome  modification  strategies  into  SDN-1,  SDN-2  or  SDN-3  facilitates 
description  of  the  characteristics  associated  with  each  technique.  These  techniques  have  been  a 
subject of debate, with the Scientific Committee in agreement that:  
o  SDN-2  differs  from  SDN-1  through  use  of  a  template  allowing  modification,  by 
recombination, of the gene targeted by the nuclease-induced break. 
o  SDN-2 differs from SDN-3 because in the case of SDN-2 the modified gene is present 
in the plant, remains in its location in the genome and keeps its copy number. 
o  The boundary between SDN-2 and SDN-3 is not necessarily clear. With SDN-2, the 
new DNA  sequences obtained could  lead, for example,  to  formation of new  RNA 
(even short, such as small RNA) or new forms of RNA expression control, as could 
SDN-3. The level of similarity used in order to distinguish SDN-2 from SDN3 will have 
to  be  determined on case by  case  if this is required for regulatory purposes  (see 
Section 7). 
 
2.3. Considerations concerning delivery and effector insertion in the target cell 
The question of vectors and effector insertion/persistence in the cell is fundamental to any discussion 
of risks and traceability for varieties obtained by NPBTs. Vector/effector persistence can affect risk (see 
Section 5.2.1) but can also, in some cases, be used to identify a product obtained by these techniques 
(see Section 3.3).  
At the moment there are a number of delivery methods for introducing effectors. 
 
 
 
 
                                                           
54 See paragraph on novelty in the introduction (Section 1.3). 
23 
 
 

2.3.1.  Transformation using Agrobacterium tumefaciens bacteria 
Agrobacterium tumefaciens bacteria cause crown gall disease in some plants. When these bacteria are 
used for plant transformation, the Ti-plasmid55 T-DNA genes are replaced and the strain is unable to 
cause the disease (Simpson et al., 1986). 
Agrobacterium carrying the construct to be transferred is placed in contact with the plant cells and 
transfers recombinant T-DNA into their nuclei. Various techniques (see Appendix VII) are used to select 
the transformed cells and then regenerate them into whole plants. For some species it is possible to 
inoculate the floral organs with Agrobacterium, allow the fruit to grow and then select the transformed 
seeds (obtaining up to several per cent of transformed seed out of all the seed produced (Bechtold et 
al.,  1993)).  For  NPBTs,  Agrobacterium  is  placed  in  contact  with  tissue  that  will  not  be  used  for 
reproduction but be ground to extract a metabolite of interest (vaccine, etc.). 
 
2.3.2.  Direct transformation 
Direct transformation techniques cover all the methods employed to introduce macromolecules into 
plant cells by chemical or physical means without using Agrobacterium
•  Protoplast transformation 
Plant cells have their pecto-cellulosic walls removed by enzyme digestion (thus becoming protoplasts), 
and  DNA,  RNA  or  proteins  are  introduced  through  the  cell  membrane  using  molecules  (such  as 
polyethylene glycol) or electric shocks that transiently weaken this membrane, making it permeable. 
In the case of CRISPR/Cas9, the Cas9 protein and guide RNA can be introduced directly (Woo et al., 
2015), and therefore no DNA is inserted. 
•  Biolistics 
Microscopic  gold  or  tungsten  particles  coated  with  DNA  or  RNA  are  shot  into  plant  cells  in  vitro 
(bombardment). The molecules on these particles are projected into the cell nucleus, upon which they 
act. Trials are under way with bombardment using pre-assembled nucleoprotein complexes. 
It is possible, after selection, to regenerate whole plants from the transformed cells. If a flower bud is 
bombarded rather than individual cells, it is possible to grow the plant until seed is produced and then 
to select the transformed seed. 
•  Whiskers 
Needle-like metal fibres (whiskers) coated with DNA are mixed with plant cells at high speed, impairing 
the  cell  membrane  and  allowing  the  DNA  to  penetrate  the  cytoplasm  and  then  the  nucleus.  This 
technique has been used for maize (Kaeppler et al., 1990; Petolino and Arnold, 2009), rice (Terakawa 
et al., 2005), and some forage plants and turf plants such as bent (Asano et al., 1991), but it is not 
widespread. 
 
                                                           
55 The endogenous bacterial sequence containing the genes responsible for crown gall disease. 
24 
 
 

2.4. Methods for selecting modified cells and plants and deleting marker transgenes 
Genetic engineering methods are often inefficient, and most of the cells obtained are not modified. It 
is therefore necessary to use methods for selecting modified cells. This can be done either by using a 
chemical selection agent (to eliminate untransformed cells) or by molecular screening of cells, tissue 
or plants (with PCR, for example). Selectable marker genes may be genes conferring resistance to a 
selective  agent  (herbicide, antibiotic),  metabolic markers  (use of mannose  as  a  sugar, for example: 
PMI56) or colour markers (GUS57 or GFP58) (Breyer et al., 2014). 
To avoid the selectable marker remaining in the end product, it can subsequently be removed (Gleave 
et  al.,  1999;  Yau  and  Stewart,  2013)  using  various  strategies  such  as  negative  marker  selection  by 
crossing  or  marker  excision  using  the  Cre-lox  system  or  the  R/Rs  system  from  Zygosaccharomyces 
rouxii
 (rare instances of excised DNA being maintained as episomes in the next generation have been 
reported  (Srivastava  and  Ow,  2003)).  These  strategies  thus  often  require  transgenesis  (“negative” 
segregation monitoring to eliminate the transgene).  
 
2.5. Whole-plant regeneration59 
Although transformation is carried out on culture cells, a whole plant has to be regenerated. However, 
for the time being, transition from cell culture to whole-plant regeneration has been perfected for only 
a small number of cultivated varieties. This transition can lead to genetic, epigenetic or phenotypic 
variations (the latter resulting from genetic and epigenetic changes) known as somaclonal variation 
(Anderson  et  al.,  2016;  Jiang  et  al.,  2011;  Kaeppler  et  al.,  2000;  Wei  et  al.,  2016)  unrelated  to  the 
desired modification.  
Although  induced  genotypic  variations  are  undesirable  because  associated  with  an  unwanted 
phenotype, it is possible to eliminate them from the selected plant by backcrossing with the original 
variety or to select plants not showing such variations after regeneration. 
 
 
 
                                                           
56 PMI: Phosphomannose isomerase. 
57 GUS: Beta-glucuronidase colours appropriate substrates. 
58 GFP: Green fluorescent protein, which fluoresces when exposed to a given wavelength. 
59 This stage is not subject to regulatory assessment if used for clonal propagation. Somaclonal variation can also 
be used to produce new varieties. The few commercial varieties obtained by somaclonal variation (Chawla, 2009) 
are not considered to result from induced mutagenesis for the purposes of Directive 2001/18/EC. 
25 
 
 

2.6. Transient or stable plant transformation 
The different delivery methods for the components required by SDN technology (effectors), together 
with their chemical characteristics (DNA, RNA or protein), determine whether they will be stable or 
transient. If one or more of the components needed for SDN techniques is present in a stable, heritable 
form,  the  plant  is  transgenic.  To  prevent  the  release  of  a  GMO,  the  absence  of  components  or 
component  parts  in  the  plant  obtained  must  therefore  be  proved  and  documented.  Intermediate 
products/plants  generated  while  using  the  technique  should  be  distinguished  from  the  finished 
products/plants obtained at the end of the process. 
2.6.1.  SDNs 
When  using  SDN-1,  SDN-2  and  SDN-3  techniques,  it  is  important  to  distinguish  the  desired  DNA 
modification itself, which is stable in the genome over generations, from the input of the components 
needed to bring about the modification; the latter are introduced transiently into the plant cell in the 
form of DNA, RNA or proteins (as guide RNA in CRISPR/Cas9, for example). 
The components can be introduced through:  
- Transient delivery of a protein: Introducing effectors in the form of proteins leads to a brief presence 
of proteins in the cell and is not part of nucleic acid transfer. 
Transient transgenesis: Introduction of a DNA or RNA fragment that will not be integrated in the 
genome  and will  not  be  transmitted.  This  strategy  results  in  transient  presence  in  an  intermediate 
organism of genes encoding effectors. As in the case of effector delivery in protein form, this transient 
transgenesis results in a brief presence of effector proteins and RNA in the cell (for a few hours) and is 
not part of nucleic acid transfer (Liang et al., 2015).  
Transgenesis using autonomous replicons: Introduction of a DNA or RNA fragment that replicates 
autonomously. This is the case, for example, for (RNA or DNA) virus sequences able to replicate that 
can be used to amply and express CRISPR guide RNA (VIGE: virus-induced genome editing) (Ali et al., 
2015; Baltes et al., 2014; Čermák et al., 2015; Yin et al., 2015). While some viruses that could be used 
to introduce effectors are seed-transmissible (Kil et al., 2016), most are not, and it is easy to ensure 
that the offspring do not carry the virus sequence. 
Transgenesis with integration then eventual removal: Integration of a DNA fragment in the genome 
through  stable  transgenesis.  The  transgene  can  then  be  eliminated  by  two  techniques:  crossing 
(negative segregation) or excision (see Section 2.4). If CRISPR is used there is the possibility of self-
excision, consisting in a construct that includes additional guide RNA resulting in transgene removal 
(Schaeffer and Nakata, 2015). 
2.6.2.  RdDM 
There are a number of techniques for obtaining double-stranded regulatory RNA: 
o  Transient transgenesis: Introduction of a fragment that will not be integrated in the 
genome  and not  replicate independently.  This leads to  transient presence  of the 
transgene  in  an  intermediate  organism.  Induced  methylation  can  be  stable  over 
several generations. 
26 
 
 

o  Transgenesis using autonomous replicons: Delivery of a DNA or RNA fragment that 
replicates  autonomously.  This  is  the  case,  for  example,  for  (DNA  or  RNA)  virus 
sequences that are able to replicate, known as VIGS (virus-induced gene silencing) 
(Martín-Hernández and Baulcombe, 2008; Peele et al., 2001).  
o  Integrated transgenesis and negative segregation: Integration of a DNA fragment 
in  the  genome  (transgenesis).  The  transgene  can  be  eliminated  by  crossing  or 
excision. 
 
2.7. Relationship between DNA sequence modifications and phenotype 
The question of the consequences of genetic modifications for phenotypes is an important one. It is 
not desirable for a sequence modification to bring about unwanted alterations in the plant that might 
then entail risks if the plant is grown or eaten. Significantly, the Scientific Committee nonetheless notes 
in this respect that: 
o  Genetic modifications introduced into crop plants will mostly be modifications of 
sequences  that  are  either  known  or  which  exist  but  have  not  been  molecularly 
characterised. These modifications are intended to reproduce a variation associated 
with  a  phenotype  of  agricultural  interest.  The  Scientific  Committee  recommends 
that modifications whose effects are novel60 (because of a new gene function, for 
example) should be carried out in the laboratory prior to any cultivation. Agricultural 
use of a particular variation will have to be studied on a case-by-case basis. 
o  It is possible to find phenotype modifications caused by mutations in functional non-
coding sequences. The sequences that will be used must therefore be identified and 
characterised. This is a prerequisite if they are to be modified for the purposes of 
plant breeding. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                                           
60 See definition of novelty in Section 1.3. 
27 
 
 

3.  Assessment and traceability methods for plants and products obtained by 
NPBTs (Point 1 of the referral) 
In this section the Scientific Committee discusses the presence or absence of effectors in SDN technology 
and  the  difference  between  the  effector-free  end  product  and  the  intermediate  product  transiently 
expressing effectors.  

 
3.1. Background  
3.1.1.  Regulatory environment 
GMOs for contained use 
As long as they are not intended to be released and placed on the market, genetically modified plants 
are  not  traced  under  Directive  2001/18/EC.  However,  in  France  they  are  covered  by  reporting  for 
contained use of GMOs,61 which provides for laboratory traceability through a register of GMOs. Thus 
if the plants grown in a contained environment are to be used to breed plants placed on the market, a 
complete “genealogy” of the variety can be provided. 
 
Released GMOs 
At  present,  traceability  of  GMOs  and  derived  products  from  them  is  covered  by 
Regulation (EC) No 1830/2003.  This requires  tracking of  genetically modified seed yielding  products 
intended for industrial or food processing for food or feed consisting of, containing or produced from 
GMOs,  including  additives  and  flavourings.  For  all  these  products,  throughout  their  supply  chains, 
operators must inform their customers in writing of the presence of GMOs, thus allowing them to use 
appropriate labelling.  
In France, checks are carried out by the DGCCRF62 on the basis of annual sampling plans for assays to 
detect, identify and quantify any GMOs and thus check labelling compliance. Similarly, the DGAl63 has 
an annual seed monitoring plan.  
To  carry  out  these  checks  the  competent  authorities  use  methods  and  molecular  tools  that  the 
Scientific Committee wishes to clarify. 
 
3.1.2.  Definitions 
The  Scientific  Committee  would  like to  define  what  it  understands  by  detection  and  traceability  of 
plants and products derived from plants obtained by new plant breeding techniques (NPBTs). 
                                                           
61 Reporting regulated within the scope of Directive 2009/41/EC. 
62 Directorate General for Competition Policy, Consumer Affairs and Fraud Control (Ministry for the Economy). 
63 General Directorate of Food (Ministry of Agriculture). 
28 
 
 


o  Detection: Ability to confirm the presence of an entity obtained by NPBTs in a given 
sample. The accuracy of the information on the nature and quantity of the entity 
present  will  depend  on  the  approach  used,  the  detection  methodology  and  the 
extent of available knowledge about the entity. For each technique, there is a cut-
off value below which detection becomes impossible. This is not a fixed value, and 
it can be brought down with individual improvements to each detection technique. 
o  The limits of detection of a known modification will depend on the NPBT and the 
technical limits of the methods used for detection. Detection is made even harder 
by dilution in the case of mixtures. 
o  Detection  by  screening:  Ability  to  recognise  the  presence  of  genetic  elements 
revealing  the  existence  in  the  sample  of  an  entity  obtained  by  NPBTs,  without 
necessarily allowing exact identification.  
The genetic elements investigated may reveal part of a modification sequence or 
the technique employed to generate it.  
In  the  case  of  GMOs,  they  are  mainly  the  genetic  elements  constituting  the 
transformation  cassettes.  In  some  cases  the  elements  detected  may  suggest  the 
presence  of  a  known  GMO  whose  identity  must  be  verified  by  a  specific 
identification  test.  Detection  by  screening  can  reveal  the  presence  of  partially or 
wholly unnotified transformation events.64 
o  Identification:  Ability  to  be  certain  that  an  entity  obtained  by  a  given  NPBT  is 
present in the sample tested. 
For  GMOs,  this is based on  detection of junction  fragments  between the  genetic 
elements  making  up  the  transformation  cassettes  (construct-specific  detection 
tests)  or  between  the  insert  and  the  surrounding  plant  genome  (event-specific 
detection tests).  
o  The limits of identification for an unknown technique or modification will depend 
on  the  NPBT  and  in  particular  the  possibilities  of  natural  genome  variation  (see 
Section 1.4). 
 
 
Figure  2:  Potential  targets  for  GMO  detection/identification  by  PCR  amplification.  The  oligonucleotides  used  for  PCR  are 
shown below. In the case of NPBTs this detection strategy can be used for SDN-3, intragenesis and cisgenesis (Type 1 and 
Type 3 oligonucleotides for the latter). 
                                                           
64 Because the number of transgene sequences is “relatively” limited at present. 
29 
 
 

 
o  Quantification: Ability to measure the quantity in the sample of an entity obtained 
by a given NPBT by comparison with the total genomic quantity of the species to 
which it belongs. For GMOs this quantification is necessary in order to be able to 
apply  the  labelling  rules  (mandatory  if  the  threshold  for  authorised  unintended 
presence is exceeded (Regulation (EC) No 1829/2003)). 
 
o  Traceability: Ability to trace the history, location and uses of an entity obtained by 
NPBTs using registered identification documents. Traceability systems must comply 
with  national  and  international  standards  (ISO  9000-2005,  ISO  9001-2008,  ISO 
22000, NF ISO 22004, ISO 22005-2007) and are designed to be as uniform as possible 
within supply chains. They are based on standardised records, which have to be kept 
for a given length of time (usually at least 5 years). In the EU, GMO traceability is 
based on assignment of a unique identifier for each authorised event, enabling all 
its uses to be tracked (“from farm to fork”) when it is being placed on the market 
(Regulation (EC) No 1830/2003 and Regulation (EC) No 65/2004). 
These concepts are addressed for GMOs in the HCB opinion of 17 January 2012 on coexistence.65 
 
3.1.3.  Scientific Committee approach 
First of all, the Scientific Committee would like briefly to recall the genetic and phenotypic methods 
available  for  detecting  GMOs.  These  methods  will  form  the  basis  for  the  subsequent  discussion  of 
detection of plants and products obtained by NPBTs, but new approaches could be developed. 
The  Scientific  Committee  has  considered  methods  of  detecting  and  identifying  unintended 
modifications induced by some NPBTs at the delivery and somaclonal variation stages. Delivery is used 
for  conventional  transgenesis  and  some  NPBTs  (see  Section  2.3)  but  not  in  conventional  breeding 
methods involving natural variation or plants obtained by mutagenesis.  
The Scientific Committee has discussed detection of effectors used for some NPBTs, whilst noting that 
these effectors have to be removed from the plants before the latter are placed on the market; if this 
is not done, the plant could be considered to be transgenic because of the integration of exogenous 
sequences.  
Each type of NPBT has been studied in individual fact sheets (Appendix VII). The summary tables at the 
end of this section are preceded by a list of biological information that the Scientific Committee would 
deem necessary to facilitate traceability of a plant/product obtained by NPBTs.  
Plant/product detection, identification and traceability are there addressed in terms of the following 
three questions: 
•  Is the modification detectable in plants and their products if it is documented? 
                                                           
65  http://www.hautconseildesbiotechnologies.fr/fr/avis/avis-sur-coexistence-definition-conditions-techniques-
relatives-a-mise-culture-recolte-stockage 
30 
 
 

•  Can the technique used to obtain this modification in the plant and its products be identified 
without documentation? 
•  If detection is possible, can it be used to find adventitious presence in mixtures of varying 
complexity during the production, processing and distribution process? 
 
3.2. Detection of plant and products derived from GMOs 
On the market, it must be possible to detect and identify GMOs and derived products in order to ensure 
that they are traceable throughout the food chain. To this end, an identification method that has been 
developed by the notifier and subsequently validated is required whenever an application is submitted 
for authorisation of any new genetic transformation event in Europe. 
GMO detection targets can be transgenic DNA sequences inserted in the genome, the RNA transcribed 
from these sequences, proteins obtained by RNA translation or metabolites obtained by metabolism. 
Metabolites can be detected by specific biochemical assays (e.g. lauric acid for oilseed rape, or beta-
carotene for rice). Recombinant proteins can be detected by enzyme assays (herbicide degradation, 
for  example)  and  immunoassays  (ELISA  and  strip  tests).  Transgenic  nucleic  acid  sequences  can  be 
detected  by  qualitative  or  quantitative  real-time  PCR,  Southern  or  Northern  blotting,  DNA-chip 
hybridisation and first-, second- or third-generation sequencing (next-generation sequencing, NGS). 
Multiplex methods are possible for simultaneous detection of multiple targets with different PCR and 
sequencing techniques (e.g. ligation-mediated PCR (Holck et al., 2009)). 
To optimise the screening stages, PCR detection systems using pre-spotted plates (PSP) combined with 
decision-support systems have also been developed, such as that used by the Joint Research Centre 
(JRC)  to  detect  all  GMOs  authorised  in  the  EU  in  a  single  PCR  experiment  (Rosa  et  al.,  2016)  or  a 
decision-support system combining traceability and analytical data (Bohanec et al., 2017). 
Unlike other methods, detection of transgenic DNA sequences is not affected by the level of transgene 
expression, which can vary according to the tissues or organs tested, the plant’s developmental stage, 
the genetic background or the environment. On the other hand, it may be affected by the proportion 
of the genetic component of the DNA carrying the transgene in the organ of the plant tested (and by 
the  transgene  copy  number),  for  example  in  the  seed  of  a  non-transgenic  plant  fertilised  by  a 
transgenic plant (see coexistence opinion66). 
Detection of unauthorised GMOs is based on screening and has to prove that the genetic elements 
detected do not come from authorised GMOs or non-GM sources (viruses and soil microorganisms, 
etc.), and this can sometimes be quite complicated. Ease of identification depends on the extent of 
available  knowledge  about  the  transgene  sequences  being  investigated.  Identification  is  easier  if 
information is available (for example, about an event that has been assessed but is not authorised in 
the EU, or an event not authorised in the EU that contains a genetic construct similar to an authorised 
event obtained by the same breeder). In the case of whole plants, the reasons for which a sample is 
suspected of containing a GMO (phenotype, resistance involving certain types of gene) also provide 
the information to guide identification. Conversely, if little information is available, identification may 
                                                           
66  http://www.hautconseildesbiotechnologies.fr/fr/avis/avis-sur-coexistence-definition-conditions-techniques-
relatives-a-mise-culture-recolte-stockage 
31 
 
 


entail laborious cloning and sequencing stages, which is not routinely possible at present but can only 
be done in exceptional circumstances, as in the case of litigation. 
Detection of unknown GMOs for which no information is available, whether for the sequence or the 
recombinant  protein obtained,  is also based on  screening,  but this cannot detect GMOs  containing 
only genetic elements not yet described in testing laboratories’ databases. As regards sensitivity, the 
quantity of genetic material present in the sample tested may affect detection capability. 
Approaches  based  on  blind  comparison  of  omics  data  (whole-gene  sequencing,  proteomic  and 
transcriptomic  data)  for  the  sample  tested  and  its  unmodified equivalent  are  being  studied  (Holst-
Jensen et al., 2012) but still seem hard to envisage as a matter of routine. Developments in technology 
have indeed permitted a gradual reduction in the production time and costs for this type of data but 
have  not  removed  the  problems  relating  to  the  time  and  skills  required  for  the  subsequent 
bioinformatics analysis or the problems relating to existence of reference genomes, environmentally 
induced plant variation or the effect of physiology on levels of gene expression.  
  
 
Figure 3: Sample testing procedure to find GMOs and consequences for labelling. A sample is considered to test negative for 
GMO presence below the limit of detection for the detection technique used and positive if this limit is exceeded. The 0.9% 
and 0.1% thresholds shown above reflect French GMO regulations. 
 
32 
 
 

3.3. Detection of delivery technique 
For a notified genetic modification, detection can focus on the modification itself. However, in addition 
to  the  target  modification,  methods  employed  to  obtain  the  genetic  transformation  (delivery, 
transformation, selection) may sometimes leave traces that can be used for detection. 
 
3.3.1.  Agrobacterium 
Agrobacterium is often used to introduce the components for SDNs, cisgenesis, intragenesis, negative 
segregants  and  RdDM.  The  Scientific  Committee  has  discussed  possible  persistence  of  small  DNA 
fragments from Agrobacterium in the target zone (Brunaud et al., 2002) and elsewhere in the genome 
(Schouten and Jacobsen, 2007). 
Depending on the size of the fragments, they could be detected by Southern blotting (>50 or 100 bp, 
depending on the size of the genome, etc.) or PCR (>20 bp). In the case of small fragments (<20 bp) 
next-generation sequencing should enable them to be identified, within certain limits.  
The number of these fragments can be drastically reduced by crossing with a non-transgenic plant if 
these  fragments  are  not  genetically  linked  to  the  genes  involved  in  the  traits  selected.  While  the 
Scientific Committee therefore agrees that these fragments may exist, it nevertheless finds that using 
them for plant  identification or  traceability would be  difficult and  unreliable. On the other hand,  if 
insertion of these fragments were documented, they would be easily detectable. Once identified in a 
variety, they could be traced. 
In  the  same  vein  the  Scientific  Committee  has  discussed  possible  persistence  of  Agrobacterium  in 
transformed plants over one or two generations. Agrobacterium associates naturally with plants. The 
Scientific Committee agreed that the presence of Agrobacterium with a modified Ti plasmid could not 
always  be  used  to  detect  genetically  modified  plants,  since  most  of  the  bacteria  were  usually 
eliminated by antibiotic treatment in the laboratory after the transformation stage and their presence 
would be minimal or non-existent after one or two generations of plants. They would definitely be 
absent  from  the  seed  that  was  marketed.  Although  natural  unmodified  Agrobacterium  might  be 
detected,  this  would  not  be  proof  that  the  plant was  transgenic,  since  these  bacteria  are  naturally 
present in soil. The Scientific Committee concluded that presence of Agrobacterium with a modified Ti 
plasmid could not be used to classify plants as genetically modified. 
 
3.3.2.  Direct transformation (protoplast, biolistic, etc.) 
Direct transformation techniques are not detectable in the plant thus obtained. However, fragments 
of the vectors inserted can be detected in the same way as for Agrobacterium
A report has shown that in plant protoplasts transfected with a plasmid encoding the nuclease and 
guide RNA, in 0.06% to 0.14% of cases small insertions of plasmid DNA were observed at the cleavage 
site (Kim and Kim, 2016). However, given the randomness of the insertion and the rareness of these 
events, and in view of the fact that these plants would certainly not be selected by breeders, these 
events cannot be used for detection. 
33 
 
 

3.3.3.  Viruses 
If a viral replicon is used to express the components of modifications (for example, an RNA or DNA 
virus to express the guide sequence in the CRISPR SDN technique (Yin et al., 2015)), its detection, if it 
persists, could provide evidence of the technique used. 
 
3.4. Effector detection67  
If the effectors for SDN and RdDM techniques are not removed, the end plant will inevitably be covered 
by  GMO  regulations.  Effector  detection  is  thus  a  crucial  step  (see  Section  7).  Effector  detection 
methods can also be used for monitoring programmes, particularly regarding SDN-1, SDN-2 and SDN-
3 techniques.  
Effectors can be detected by PCR and RT-PCR68 if the effector sequences are known (notification or 
database listing all guide RNA and nuclease sequences used). Frequent use is made of some effectors, 
such  as  Cas9  and  its  tracrRNA,  various  meganucleases,  and  nucleases  such  as  TALENs  and  ZFNs.  It 
should  be  possible  to  use  parts  of  these  sequences  that  have  been  kept,  taking  account  of  codon 
modifications  according  to  the  species.  Use  of  primer  mixtures  can  help  to  identify  even  partially 
modified effectors (truncated or silenced). This question of effector detection must be reviewed in the 
light of technological developments. It is essential to be able to detect any effectors persisting, as in 
the case of non-transient DNA delivery, for example. 
3.5. Overview of detection of plants and products obtained by NPBTs 
3.5.1.  A supporting document for NPBT detection, identification and traceability 
The Scientific Committee has agreed on a list of biological information needed to facilitate traceability 
of a plant/product obtained by NPBTs. In this opinion, the term documentary traceability refers to this 
list (it would not be mandatory to use this list in full on labelling):  
Supporting document for a product obtained by NPBTs: 
Mandatory biological information for traceability: 
•  Species and variety; 
•  Breeding method; 
•  Delivery method (if applicable); 
•  Tissues targeted by modification; 
•  Trait(s) modified or introduced; 
•  Phenotyping method; 
•  Target region sequences (before and after modification) and chromosome location;  
                                                           
67 See definition of effector in the introduction. 
68 RT-PCR: Reverse transcription of RNA, followed by PCR. 
34 
 
 

•  Presence or absence of effectors needed for SDNs (if applicable); 
•  Unique identifier, as per the standard, if possible. 
 
 
3.5.2.  Summary tables 
 
See next pages. 
35 
 
 

 
 
Table 1: Summary of options, by technique, for detection and identification of breeding method 
 
                         Techniques 
SDN-1 end product (i.e.  SDN-2  end  product  (i.e.  effector- SDN-3 
ODM 
 
 
effector-free) 
free) 
(Sequence insertion) 
(Oligonucleotide-directed 
(Site-specific mutation)   
mutagenesis) 
 
Issues 
(Allele conversion) 
 
Detection of DNA modification69 
Yes 
Yes 
Yes 
Yes 
 
Stable insertion of foreign DNA 
No 
No 
Yes 
No 
Identification of breeding 
No 
No because comparable to a  
Yes unless there is a 
Generally no. 
method 
natural variant. 
natural equivalent.  
Possible if modification is 
Possible if modification is 
Sometimes possible if  combined with a molecular 
combined with a molecular 
combined with a 
signature.70 
signature.70 
molecular 
 
signature.70 
 
Breeding by a technique listed in  Yes 
Yes 
No unless the 
Yes 
Annex 1 B of 
modification could 
Directive 2001/18/EC 
occur naturally. 
Field coexistence: detection 
Yes71 and if phenotype 
Yes71 and if molecular signature, 
Yes:71 GMOs. 
Yes71 and if phenotype and 
and trait are not 
or if phenotype and trait are not 
trait are not present in 
present in growing 
present in growing area. 
growing area. 
area. 
 
 
                                                           
69 Identification of a genetic modification in an organism’s genome does not indicate how it was obtained. 
70 A molecular signature would consist in inserting a predefined pattern of nucleotides unlikely to be found in nature. It would thus be possible to ascribe a mutation to a technique 
rather than just selection of a natural variant. 
71 Yes if the modification is transferred, which will depend on the plant’s method of pollination. 
36 
 

 
                                     
Techniques 

Non-GM scion on SDN-1, SDN-2 or 
Non-GM scion on SDN-3 or transgenic 
GM scion (SDN-1, SDN-2, SDN-3, ODM, cis- & 
 
ODM rootstock 
rootstock  
intragenesis) on non-GM rootstock 
Issues 
Detection of DNA modification  Yes for rootstock. 
Yes for rootstock. 
Possible for scion. Refer to modification 
No for scion and fruit. 
No for scion and fruit. 
techniques (see table on previous 
page). 
Stable insertion of 
No 
Yes for rootstock. 
Possible: SDN-3, cisgenesis and 
recombinant DNA 
intragenesis. 
Identification of breeding 
No for whole plant, except for 
Possible for rootstock.72 
See table on previous page. 
method 
rootstock with molecular signature. 
No for scion and fruit. 
 
Breeding by a technique listed 
Yes 
No, apart from some types of 
See table on previous page for each 
in Annex 1 B of 
cisgenesis. 
technique. 
Directive 2001/18/EC 
Field coexistence: detection 
Yes for the transgenic part requiring 
Yes for the transgenic part requiring 
See table on previous page for each 
authorisation. 
authorisation. 
technique. 
 
 
 
 
 
 
 
 
                                                           
72 See SDN-3 column on previous page for specific detection problems. 
37 
 

 
 
 
Intragenesis 
                                   Techniques 
RdDM  
Cisgenesis 
(introduction of recombinant 
 
(RNA-directed DNA 
Agro-infiltration 
(introduction of DNA from a 
DNA from a sexually 
Issues 
methylation) 
sexually compatible species) 
compatible species) 
Detection of DNA modification  Yes and technically complex.  Yes 
Yes 
Yes 
Stable insertion of 
Depending on technique 
No 
Yes 
Yes 
recombinant DNA 
Identification of breeding 
Yes if transgenesis. 
Yes, transiently. 
Yes if transgenesis by 
Yes 
method 
Agrobacterium
No if RNA, CRISPR. 
No if the genetic 
modifications could occur 
naturally 
Breeding by a technique listed 
Yes 
No, but not relevant: mostly 
Possible in some cases. 
No 
in Annex 1 B of 
transient expression. 
Directive 2001/18/EC 
Field coexistence: detection 
Unstable heritability and 
Not relevant owing to 
Transfer depending on 
Transfer depending on 
varying contribution to 
contained use. 
plant’s pollination method. 
plant’s pollination method. 
gamete profile depending on 
 
 
plant. 
 
38 
 


 
3.5.3.  Conclusions 
In  most  cases  if  information  about  the  modification  is  available,  plants  and  products  from  plants 
obtained  by  NPBTs  can  be  identified.  However,  it  will  not  always  be  possible,  especially  with  no 
context, to be certain that the modification found actually results from use of an NPBT rather than 
being  a  natural  modification,  or  even  obtained  by  another  technique:  carrying  out  checks  without 
traceability data is likely to produce a large number of false positives. A sample is considered to test 
negative  for  presence  of  a  plant  obtained  by  an  NPBT  if  it  is  below  the  limit  of  detection  for  the 
detection technique used and positive if this limit is exceeded. 
Lastly, in some cases (negative segregants or some types of grafting in particular), even with the help 
of molecular traceability data, it will not be possible to identify products of plants obtained by NPBTs. 
 
Figure 4: Potential sample testing procedure to find a modification induced by an NPBT. 
 
 
39 
 

 
4.  Implications  for  supply  chain  coexistence  (Point  2  of  the  referral  in 
connection with the previous point)  
For this section the following points were discussed in the Scientific Committee’s working sessions: the 
commercial  and  non-environmental  aspects  of  individual  supply  chains  and  their  coexistence  (as 
opposed to coexistence of GMOs and the environment).  

 
Coexistence  seeks  to  allow  each of  the  parties  involved  in the  different  supply chains  (agricultural, 
seed, food-processing) to ensure compliance with their own rules. At present, coexistence in France 
concerns three types of products:73  
o  Containing GMOs (over 0.9%),  
o  Not containing GMOs (under 0.9%),  
o  GMO-free (under 0.1% or under 0.9% in France), including the organic supply chain. 
The  object  is  not  to  protect  health or the environment,  since  authorised  plants  have  already  been 
assessed, but to organise production in such a way that supply chains that do not wish to use NPBTs 
or their products are able to avoid doing so. 
4.1. End product versus plant breeding method 
For supply chains interested only in the end product: i) If varieties are obtained by NPBTs74 whose 
products  result  from  the  genetic  diversity  of  the  species  itself  or  closely  related  species,75  and  ii) 
inasmuch as the properties of these plants are indistinguishable from those that could be obtained by 
crossing or other exempted techniques, the question of coexistence does not arise, since there can be 
no distinction. 
For NPBT-derived varieties that could not have been selected from the genetic diversity of the species 
or closely related species,76 the question of coexistence does arise.  
It  should  be  noted  that  some  supply  chains  interested  only  in  the  end  product,  whilst  prohibiting 
certain traits such as herbicide tolerance or Novel Traits, could lay down their own specifications. If 
these supply chains are officially recognised, specific measures could be proposed. 
For supply chains interested in the plant breeding method: While it is not always possible to detect 
and identify a  modification,  it  is nevertheless  possible  to trace  it with a documentary record.  Here 
again, these supply chains will have to provide specifications. As for the risk of adventitious presence 
of  the  modification,  a  best-endeavours  obligation  could  be  considered  (volunteer  monitoring, 
separation  distances,  buffer  zones,  border  removal,  segregated  supply  chains  for  seed  production, 
                                                           
73 Regulation (EC) No 1830/2003 (EC, 2003) and Decree No. 2012-128 of 30 January 2012 on “GMO-free” labelling 
of foodstuffs (see Figure 3). 
74 SDN-1, SDN-2, RdDM and in some cases intragenesis and cisgenesis. 
75 Closely related sexually compatible species with which hybridisation is possible. 
76 See previous footnote. 
40 
 

 
etc.),  whereas  an  absolute  obligation  could  be  hard  to  enforce  owing  to  lack  of  routine  detection 
methods.  
 
4.2. If Directive 2001/18/EC were to be interpreted as excluding plants obtained by  some 
NPBTs 
If Directive 2001/18/EC were to be  interpreted as excluding  plants  obtained by  some  NPBTs, there 
would not at present be a specific supply chain for these plants. However, each supply chain could lay 
down  its  own  specifications  within  the  limits  of  traceability  techniques  (including  documentary 
traceability) without affecting the rules. 
 
4.3. If  Directive  2001/18/EC were  to  be interpreted as  including  plants  obtained  by  some 
NPBTs 
If the European Commission were to include plants obtained by some NPBTs in Directive 2001/18/EC 
or  were  to  introduce  another  specific  interim  regulation,  the  question  of  detection  would  become 
critical. It would then be necessary to distinguish between modifications that had been notified and 
those that had not. The situation would also vary according to whether genetic modifications were to 
be detected in a crop in France or in an imported batch. Last but not least, the situation would depend 
on the type of NPBT used.  
If  a  modification  is  identified  (by  its  molecular  description,  for  example),  detection  is  possible  – 
although  without  systematic  attribution  to  a  technique  –  for  some  NPBTs  such  as  SDNs,  ODM, 
intragenesis and cisgenesis, and it will be very difficult for RdDM and grafts on GMOs (in most cases) 
and virtually impossible for negative segregants. 
If  a  modification  is  registered  in  data  banks,  detection  is  possible  for  genome  editing  techniques 
(mutation, “methylation”) as well as negative segregants and grafts if a screening method has been 
developed, particularly with high-throughput sequencing. But it will sometimes be impossible to tell 
whether the modification observed has actually been obtained by using an NPBT. 
If genetic and phenotypic modifications are not registered in data banks, the technical limitations 
outlined  above  would  make  it  harder,  and  even  for  some  NPBTs  virtually  impossible,  to  detect 
presence, whether adventitious or not, of products obtained by NPBTs in an “NBPT-free” supply chain. 
As has already been done for existing GMOs (Holst-Jensen et al., 2012; Petrillo et al., 2015), developing 
appropriate  detection methods  and data banks  therefore seems a prerequisite for separate supply 
chains with labelling to match. 
The  Scientific  Committee  notes,  however,  that  the  type  of modified  products  and  the  regulatory 
thresholds for their presence will affect detection capabilities, with detection becoming impossible 
in many cases. 

 
41 
 

 
5.  Direct  risks  to  health  and  the  environment  associated  with  novel 
characteristics of products obtained (Point 3 of the referral) 
The Scientific Committee discussed the mainstreaming of GMO cultivation and consumption over the 
past 20 years, together with the impact on human, animal and environmental microbiota. For each of 
the risks identified it further examined whether it was a direct risk and associated with the products’ 
novel  characteristics.  The  definition  of  off-target  modifications  was  clarified.  The  possibility  and 
potential consequences of undetectable persistence of active effectors was discussed. 

The  HCB  Scientific  Committee  will  here  address  foreseeable  risks,  since  it  is  impossible  to  discuss 
development risks77 at this point as they are unforeseeable by definition. We may assume that future 
developments in scientific and technological knowledge will alter our understanding of the risks and 
bring about a change in the management measures needed as a result. 
Risk is the consequence of an identified danger (or source of damage) and exposure to this danger 
(likelihood of damage occurring).  
Under  Directive  2001/18/EC  (Annex  II)  and  Regulation  (EC)  No 1829/2003,  any  potentially  harmful 
characteristics associated with a genetically modified (GM) plant are assessed by comparing them with 
the characteristics of an equivalent non-GM plant, used as a comparator. The biological relevance of 
statistically significant differences is used to formulate risk hypotheses which are subsequently tested.  
•  For assessment of health risks associated with a genetically modified plant for food use, the 
biological  relevance  of  a  difference  between  the  GM  plant  and  its  non-GM  equivalent  is 
determined by comparison with a batch of non-GM reference varieties with a history of safe 
use.  
•  For environmental risk assessment, the comparative assessment procedure is recommended, 
but  because  the  concept  of  safe  use  does  not  apply  to  the  effects  of  agriculture  on  the 
environment,  equivalence  limits  are  determined  not  by  limits  of  variation  but  by  limits  of 
concern.78  In other words,  any characteristics of the  GM plant  not measured  in connection 
with  environmental  protection  goals  will  be  subject  to  an  in-depth  risk  assessment.  One 
recurrent problem is how to define these goals. 
Exposure  assessment  is  based  on  a  pre-estimate  of  the  crop  area  and  consumption  of  products 
obtained from it. This parameter hinges on farmers’ adoption of the modified variety/varieties.79 This 
adoption, which is often hard to predict, varies according to sundry social and economic parameters, 
the impact of climate and also the strategies of the various parties involved in the supply chains (Bonny, 
2008). This is true for all farming, whether or not it entails use of genetically modified varieties.  
According to Directive 2001/18/EC (Annex II), direct risks refer to primary effects on human health or 
the environment which are a result of growing the GMO itself and which do not occur through a causal 
                                                           
77  A  development  risk  is  defined  as  a  risk  that  is  unknown  when  a  product  is  launched  and  which  becomes 
apparent through a subsequent growth in scientific and technological knowledge over time. 
78  This  term  denotes  the  limits  beyond  which  a  given  characteristic  will  be  of  sufficient  magnitude  to  cause 
environmental harm (according to EFSA, 2010). These limits are defined in relation to environmental protection 
goals. 
79 The Scientific Committee notes that exposure relates to the trait rather than the variety; thus if the same trait 
is present in a number of different varieties, adoption of all these varieties must be taken into account. 
 
42 
 

 
chain of events. Indirect risks refer to effects on human health or the environment occurring through 
a causal chain of events, through mechanisms such as interactions with other organisms, transfer of 
genetic material, or changes in use or management.80 
The “novel characteristics of products obtained” are twofold: those resulting directly from the desired 
traits and those resulting from unintended effects of the techniques used to obtain these traits. 
The points to consider are:  
o  Delivery method (when used); 
o  The fact that modifications are directed (genetic directionality); 
o  The option of making several modifications at the same time (multiplex genome 
editing). 
In addition to the product obtained, the genetic engineering process must thus be taken into account 
in risk assessment, for two reasons:  
o  There  may  be  risks  associated  with  the  modification  technique,  for  example  the 
novelty  constituted  by  delivering  proteins  or  nucleic  acids  to  plant  cells  by 
comparison with traditional selection;  
o  The much greater effectiveness of these techniques in generating varieties with one 
or  more  traits  with  potential  monetary  value  for  agriculture,  combined  with  the 
faster pace of innovation that farming will be facing (since adoption of innovation is 
not directly connected with use of NPBTs but depends on a number of social and 
economic  factors),  could  lead  to  a  wider  choice  or  supply  of  varieties81  and 
potentially to wide adoption by farmers and therefore substantial exposure.  
The HCB Scientific Committee notes that these risks are not mutually exclusive. 
The  HCB  Scientific  Committee  wishes  to  point  out  that  although  the  referral  relates  to  direct  risks 
associated with novel characteristics of the products obtained, it has identified a number of indirect 
risks and risks not associated with these novel characteristics. As with all human activities, farming and 
placing varieties on the market has risks. Such risks apply as much to NPBTs as to varieties obtained by 
traditional methods  (crossing),  regulated  methods  (transgenesis) or  unregulated  methods  (induced 
mutagenesis).  These  indirect  and/or  non-specific  risks  are  listed  in  Appendix  V.  The  Scientific 
Committee also notes that traits would be introduced for their agricultural value, which it is therefore 
important to consider in assessment. 
 
5.1. Risks arising from desired traits 
The Scientific Committee would like to stress the following three points: 
                                                           
80 For example, toxicity and the plant’s effect on non-target organisms or soil microorganisms would be direct 
risks. Examples of indirect risks would be onset of tolerance to a toxin or emergence of herbicide-resistant plants 
through selection or gene transfer.  
81 Introduction of different rates of early maturing in more varieties and/or introduction of the same trait into 
several species used in crop rotation. 
 
43 
 

 
o  Use of NPBTs does not automatically mean that novel traits will be obtained (not 
restricted to novelty).82 The particular merit of SDN-1, SDN-2 and ODM techniques 
lies in the ability to introduce the characterised allele of one variety into a different 
variety in just a few stages. 
o  Some traits obtained by these techniques could be obtained by other techniques 
not  covered  by  GMO  regulations  (crossing  of  natural  variants  or  random 
mutagenesis)  or  by  regulated  techniques  (transgenesis):  disease-resistant  or 
herbicide-tolerant plants, for example (duplication of techniques). 
o  Some  techniques  require  introduction  of  foreign  genetic  material  transiently. 
Persistence of the (RNA, DNA or protein) effectors used for the modifications, and 
of the vector (Agrobacterium, virus, etc.), is a risk specific to these techniques (see 
Section 5.2). The absence of these molecules and vectors must therefore be verified. 
If the such molecules persist, which the Scientific committee considers undesirable 
since  technically  avoidable,  an  assessment  of  the  risks  associated  with  this 
persistence should be carried out. 
Once the absence of vectors and effectors has been verified, the direct risks are common to all genome 
modification  techniques  and to crossbreeding  (see Appendix  V).  Uncertainty concerning these risks 
will  logically  increase  as  the  gap  with  the  species’  intrinsic  genetic  variability  grows  and  the  trait’s 
novelty becomes established. 
On the other hand, the Scientific Committee notes that, although this is not included in the terms of 
reference (direct risks), changes in farming practices and food-processing procedures connected with 
the new traits (indirect risks) should be assessed on a case-by-case basis, since they can themselves, 
like  all  human  activities,  have  consequences  for  the  environment  and  human  health.  Similarly, 
although  outside  the  scope  of  the  referral,  the  question  of  the  expected  benefits  of  use  of  NPBTs 
should also be taken into consideration by policymakers. 
 
5.1.1.  Risks  associated with  modification  of  crop  plants  not previously  genetically 
modified 
These are risks generally associated with plant breeding but which might become more frequent in 
connection  with  NPBTs,  owing  to  the  latter’s  ease  of  use.  NPBT  development,  combined  with 
diminishing  costs  (this  again  being  contingent  on  the  associated  regulatory  costs),  could  lead  to 
modification of species not previously modified by transgenesis. 
The (state of the art) assessment context for associated risks would then relate to the species rather 
than just the traits modified. 
By way of example, mention may here be made of the risks associated with dispersal if crop plants 
have wild breeding partners. The issues relating to dispersal risks and hybridisation with species locally 
present in the wild have not necessarily been taken into account for species for which there are no 
transgenic varieties. Although an assessment method has already been established for other species, 
this must be adjusted case by case for each new species for which NPBTs might thus be used. 
                                                           
82 See Section 1.3 above. 
44 
 

 
 
The Scientific Committee notes that the technical capacity to regenerate plants after transformation 
severely restricts modification of new species, since regeneration methods have been developed for 
only a small number of crop species.  
 
5.1.2.  Risks associated with potential novel traits 
The Scientific Committee distinguishes novel traits (see Section 1.3) in a variety or species83 from traits 
that are not present in nature and which could be obtained using synthetic biology, for example. 
 
5.1.2.1.  Novel traits in a species84 
A novel trait in a species,85 for the purposes of this discussion, is a trait not present in varieties of the 
same species currently authorised for sale (and therefore registered in the EU catalogue), although the 
trait may  be  present  within  the  species’ genetic diversity.  Since  a novel trait  can be  selected  using 
conventional breeding methods, induced mutagenesis or transgenesis, the HCB Scientific Committee 
believes  that  genome-editing  and  epigenetic  modification  techniques  in  particular  allow  faster 
emergence of novel traits in varieties, although this risk is not specific to NPBTs. 
Among  new traits  currently  being  developed, we may mention  the following  (Ricroch and  Hénard-
Damave, 2015): 
o  Biotic  stress  resistance:  new  types  of  disease-  and  pest-resistance,  new  types  of 
herbicide-tolerance; 
o  Abiotic stress tolerance: drought, salinity, water submergence; 
o  Efficient use of soil nutrients; 
o  Nutritional  quality:  lower  antinutritional-compound  content,  higher  nutrient 
content (e.g. vitamins, minerals and fatty acids); 
o  Therapeutic molecule production. 
As well as:  
o  Petrochemical substitutes; 
o  Phytoremediation. 
 
                                                           
83 For these novel traits, Canadian Directive 94-08 draws a distinction between qualitative novelty (the new trait 
is not present in stable, cultivated populations of the plant species) and quantitative novelty (the trait in the plant 
species is present at a level significantly outside the range of that trait in stable, cultivated populations of that 
plant species). 
84 See Section 1.3 above for definitions of novelty. 
85 Which must be differentiated from a novel trait in general (see Section 1.3). 
45 
 

 
In the case of cisgenesis and intragenesis, the fact that the transgene comes from a sexually compatible 
species  or  variety  does  not  mean  that  plant  quality  and  toxicity  (for  Solanaceae:  tomatoes  and 
potatoes, for example) can be ignored. However, these risks are similar in nature to those resulting 
from  introgression  of  the  desired  gene  from  the  wild  plant  into  a  crop  plant  by  hybridisation,  as 
currently happens with conventional breeding.  
Mention may also be made of the potential risks of acclimatising species to environments where they 
cannot grow naturally (because of salinity, drought or contaminated soil, for example), which could 
lead to their adoption in new areas. As with any new farming practice, these impacts would then have 
to be assessed and/or monitored by the public authorities on a case-by-case basis. 
New traits for crop varieties could also emerge as a consequence of more knowledge about functional 
genomics.  In  both  basic  and  applied  research,  genome  editing  technology  should  itself  speed  up 
knowledge acquisition in functional genomics in the laboratory, particularly for multigenic traits (Liu 
et al., 2016). 
  
5.1.2.2.  Novel traits (synthetic biology)86 
A function not performed by the gene either in the variety or in any other related species obtained by 
molecular evolution must undergo specific assessment (see Section 7). 
 
5.2. Risks due to unintended effects inherent in NPBTs 
5.2.1.  Unintended effects associated with effector persistence 
A number of the techniques mentioned require breeding of intermediate plants into which effectors 
from  other  species  have  been  introduced.  Techniques  generating  SDN-1,  SDN-2  and  SDN-3 
modifications use nucleases and possibly guide RNA (as in CRISPR/Cas9 systems). It should be noted 
that: 
o  Persistence  of  nuclease  expression  may  result  in  a  larger  number  of  off-target 
modifications (Yee, 2016); 
o  Persistence of guide RNA alone does not seem to be associated with any specific 
risks; 
o  Persistence of a nuclease (such as Cas9) and guide RNA together may result in a 
larger number of off-target modifications; 
o  Moreover,  crossing  of  plants  containing  these  effectors  (for  example,  a  plant 
containing  Cas9  with  a  plant  containing  guide  RNA)  may  result  in  genetic 
modifications in offspring; 
o  Lastly,  in  the  particular  case  of  a  sequence  recognised  by  guide  RNA  being 
homologous to a zone in which a transgene encoding a nuclease and guide RNA is 
                                                           
86 See Section 1.3 for definition. 
 
46 
 

 
stably inserted, such situation could lead to gene drive. Thus, gene drive is highly 
unlikely if not specifically intended. It is therefore a special type of transgenesis87 
and must be assessed as such. Gene drive is not considered here. 
Release  into  the  environment  of  “intermediate”  plants  expressing  a  nuclease  transgene  is  neither 
necessary nor desirable in the case of a technique that can be used in a contained environment.88 If an 
effector  persists  in  DNA  form,  the  plant  obtained  will  meet  the  definition  of  a  GMO  and  must  be 
authorised under Directive 2001/18/EC. The Scientific Committee considers that effector persistence 
is undesirable and that applicants must ensure that commercial strains are effector-free. 
Consequently, the Scientific Committee insists that absence of effectors in DNA, RNA or protein form 
be proven prior to authorisation of placing on the market. 

Similarly, in the case of modification using RdDM (RNA-dependent DNA methylation) there would be 
the risk that the transgenic parent’s transgene (whether stable or not) might be inherited.  
In the case of agro-infiltration the risk would be that the transformation could be stably inherited by 
the  plant’s  offspring  in  the  environment.  These  would  then  be  GMOs  for  the  purposes  of 
Directive 2001/18/EC. 
In the case of non-GM scions on GM rootstocks it must be verified that no transgenes or unwanted 
products have transferred to the non-GM part and its offspring. The rootstock must be assessed in its 
own right. 
 
5.2.2.  Risks  associated  with  off-target  modifications  and  unintended  genome 
modifications  
The risk associated with unintended genome modifications is not specific to NPBTs. It can also arise 
from introgression of a trait through conventional breeding or use of induced mutagenesis, producing 
modifications that are not wanted by breeders, or even known to them. However, the HCB Scientific 
Committee has nevertheless wished to explore this risk in this section.  
Techniques  using  targeted  nucleases  (SDNs)  and  transgenes  (negative  segregants,  negative  marker 
selection,  cisgenesis,  intragenesis),  ODM,  RdDM  and  agro-infiltration  carry  the  potential  risk  of 
genome  modification  other  than  the  modification  originally  desired.  The  same  risk  exists  with 
transgenic plants and other unregulated plant breeding methods. The Scientific Committee will discuss 
unwanted  modifications  specific  to  certain  NPBTs  irrespective  of  the  related  technique  (delivery, 
protoplasts or regeneration) in this section, and, in the following, unwanted modifications that may 
also be found in transgenic GMOs or exempted techniques. 
                                                           
87 Gene drive inheritance is unusual because the transgene is inherited by a population much faster than in the 
case of Mendelian inheritance, although the gene drive regions are subject to natural mutation that may stop 
this gene drive. 
88 Despite the absence of data proving an effect, the HCB Scientific Committee cannot rule out the possibility 
that such plants may pose a risk to health and the environment. 
 
47 
 

 
In the case of site-directed genome editing techniques (SDNs, ODM, RdDM)off-target modifications 
may  occur.  Other  genome  engineering  techniques  are  not  targeted,89  and  although  they  induce  a 
number of unwanted random modifications, these cannot be called “off-target”. In the case of SDNs, 
the nucleases may act on other sites of the genome, particularly those with sequences similar to the 
target sequence. For CRISPR, off-target mutations have been found on sites differing by up to five base 
pairs  from  the  guide  RNA  (Fu  et  al.,  2013;  Jinek  et  al.,  2012;  Tsai  et  al.,  2015)  as  have  genome 
rearrangements in the case of cleavage at two separate sites (Pacher et al., 2007). These specificity 
problems also exist with other nucleases (Hendel et al., 2015; Lin et al., 2014).  
The types of off-target modification with SDNs, ODM and RdDM depend on the technique used and 
the  mode  of  delivery.  They  are  generally  much  fewer  in  number  than  the  mutations  obtained  by 
chemical mutagens and radiation (unregulated techniques) and of the same order of magnitude as 
mutations occurring naturally in plant germ cells. 
These off-target modifications are found mainly in the case of persistent expression of nucleases (Yee, 
2016) and demethylases. The Scientific Committee notes that techniques are moving towards short-
term  modification-enzyme  expression  systems  with  nuclease  combinations  having  improved 
specificity.  The  risk  of  off-target  mutation  is  thus  steadily  decreasing.  In  the  particular  case  of 
CRISPR/Cas9,  the  rate  of  off-target  modifications  depends  on  Cas9  and  guide  RNA  dosage  and  an 
optimal  choice  of  guide  RNA  (Hsu  et  al.,  2013;  Pattanayak  et  al.,  2013).  Optimisation  of  these 
parameters thus reduces the risk (Peterson et al., 2016). 
It  is  possible  to  limit  off-target  mutations  through  choice  of  guide  RNA,  but  to  do  this  the  plant’s 
genome  sequence  must  be  known.  Given  the  range  of  natural  genetic  variability,  the  reference 
sequences  will  not  necessarily  match  the  sequence of the variety  under consideration.  Non-coding 
sequences are not always known precisely, especially if they are not functional. It is therefore hard to 
identify  possible  off-target  mutations  in  non-functional  sequences,  which  do  not  have  foreseeable 
consequences. Verification by whole genome sequencing is difficult in crop plants because of the size 
and diversity of sequence repeats in these genomes. 
The off-target mutations induced are therefore hard to routinely quantify precisely for crop plants’ 
large  genomes.  Backcrossing  during  the  selection  process  can  eliminate  most  off-target  mutations 
(apart  from  those  that  may  be  genetically  linked  to  the  desired  trait,  but  these  can  be  found  by 
sequencing). Backcrossing is nevertheless technically difficult to use for perennials such as fruit trees 
or for plants that reproduce mainly through vegetative propagation. Moreover, off-target mutations 
are not easily distinguishable from the natural mutations found in all living organisms, including plants.  
Reducing off-target mutations is an active field of research. The frequency of off-target mutations can 
be reduced by using new CRISPR/Cas9 systems, to such an extent that it has recently been reported 
that  it  is  impossible  to  distinguish  these  mutations  from  natural  variation  in  cultured  human  cells 
(Kleinstiver et al., 2016). These nuclease variants retain on-target activity comparable to the original 
                                                           
89  DNA  insertion  techniques  using  Agrobacterium  cannot  target  an  insertion  region  in  the  genome,  while 
techniques using chemical or physical mutagens induce random localised mutations in the genome. 
 
48 
 

 
nuclease (70% to 140% according to the paper) with no detectable off-target activity. Other assays for 
the model plant Arabidopsis thaliana have shown similar results (Peterson et al., 2016).90 
Although  it  is  often  possible  to  remove  off-target  mutations  by  backcrossing  with  the  genetic 
background  of  varieties  that  are  going  to  be  marketed,  if  the  techniques  cost  very  little  and  for 
perennials  such  as  fruit  trees,  where  backcrossing  is  harder  to  use,  a  breeder  might  find  it  worth 
transforming  elite  varieties  directly  without  resorting  to  a  donor  parent  (thus  saving  considerable 
time). In this case, possible specific off-target mutations of the commercial genetic background would 
also  be  removed  by  backcrossing  (except  perhaps  for  some  perennials  with  too  long  a  generation 
time). 
It is theoretically possible to assess and forecast off-target mutations through bioinformatics analysis 
of sequences showing some homology to the target sequence. However, this can only be done with an 
exhaustive knowledge of the genome of the plant to be modified.  
Off-target mutations with a phenotypic effect will be detected when the plant obtained is cultivated.91 
The Scientific Committee has discussed the possibility of suggesting to breeders that identified regions 
of  the  genome  should  be  sequenced  in  the  laboratory  for  a  few  years  in  order  to  measure  the 
frequency of off-target mutations when using SDNs and ODM. This would make it possible to gather 
more  information  about  these  off-target effects  and  restrict  uncontrolled  use  of  these  techniques. 
However,  it  does  not  always  seem  possible  at  present  to  make  such  a  record,  since  it  would  be 
necessary to know the full sequence of the variety grown rather than just of the model variety for the 
species. 
 
5.2.3.  Risks associated with combining targeted modifications 
Some NPBTs open up the possibility of modifying several genes at the same time (Qi et al., 2016)). This 
multiplex gene editing represents a special use of such techniques and raises specific questions about 
risk assessment.  Thus, mutation of all  the genes  in a gene family or metabolic pathway  (metabolic 
engineering) may allow emergence of Novel Traits92 and expression of pleiotropic effects and therefore 
raise questions about the impacts and risks associated with these effects. 
Mutation of a set of genes could lead to changes in expression of other genes or metabolic pathways 
through regulatory pathways (modification of control loops, “compensatory” effects). These changes 
                                                           
90 Two translocation events were found in this paper, without its being possible to link this directly with use of 
the technique. 
91  The  Scientific  Committee  wishes  to  point  out  that  the  risks  associated  with  the  effects  of  off-target 
modifications  in  crop  plants  are  not  therefore  of  the  same  nature  as  those  that  may  appear  when  these 
techniques  are  used  in  human  therapy.  Off-target  mutations  in  patients  can  have  a  serious  impact  on  the 
functioning of their bodies and thus on their health; in this case it is thus essential to use only techniques with 
off-target effects approaching zero. The fact that human genome sequencing is possible, fast, and easy to analyse 
permits this type of validation. For plant breeding, if an unwanted mutation event were to compromise a plant’s 
viability, the plant would simply not be selected by the breeder for the breeding programme. 
92 See Section 1.3. 
49 
 

 
might not be detected in the phenotypic assessment of a variety if, for example, they modify some 
compound level or sensitivity to particular non-target pathogens, since phenotyping is not exhaustive.  
A number of traits each controlled by genetic or epigenetic modification of a locus or by a transgene 
(cisgene or transgene) can be combined in a single variety. Combination of a number of genetic and 
epigenetic  modifications  does  not  necessarily  produce  the  sum  of  their  individual  phenotypic 
modifications (phenomenon of epistasis) (Phillips, 2008). 
 
5.3. Risks  associated  with  potential  acceleration  of  breeding  owing  to  efficiency  and 
technical ease of use of NPBTs 
The Scientific Committee notes that the pace and efficiency of some new plant breeding techniques 
represents a new factor. However, it wishes to point out that any potential acceleration for crop plants 
will depend on the ability to regenerate a whole plant from a modified cell (see Appendix V) (Germana 
and Lambardi, 2016). For crop species, these targeted methods break with the process of biological 
development based on random production of variants and subsequent selection (selective breeding of 
domesticated  species).  NPBTs  guide  the  breeding  of traits  in crop  species,  which  is  thus much  less 
restricted by the  low  probability of recombinations and  random mutations  for the purposes of the 
intended trait modifications. 
NPBTs make it possible to introduce targeted improvements into a given variety and can accelerate 
the effect of breeding in crop species by targeting modifications of these plants at a number of sites 
within  a  gene  or  in  multiple  genes  simultaneously  (Cambray  et  al.,  2011;  Esvelt  and  Wang,  2013; 
Woodruff  and  Gill,  2011)  (see  multiplex  genome  editing).  These  targeted,  rather  than  random, 
modifications constitute a significant change in the breeding process. With natural genetic variation in 
a species, a number of mutations (polymorphisms) causing amino acid substitutions can often be found 
in a given  protein (see  Section 2.1).  On the other hand,  the probability of finding a given  mutation 
when sampling natural populations is very low (between 0.01 and 0.0001 (Wakeley, 2009; Watterson, 
1975)).  If  we  wait  for  a  mutation  to  appear  at  random  (that  could  subsequently  be  selected  for 
breeding) and if we are able to screen an extensive population of a billion individuals, it is probable 
that  a  predefined  new  mutation  will  be  found  in  a  given  generation.  In  such  a  population,  the 
probability of combination of two specific separate mutations would then be virtually zero (squared, 
the  probability  for  a  billion  individuals  is  in  the  region  of  10-9).  New  site-directed  mutagenesis 
techniques  are  changing  the  pace  and  possibilities  of  plant  breeding,  since  they  make  it  possible 
simultaneously to combine a number of mutations defined by earlier experiments. 
What NPBTs therefore have in common is that they are able to speed up the breeding of crop plants. 
The resulting impact cannot be assessed purely on a case-by-case basis but must also be assessed as a 
whole. 
This acceleration of the breeding process for new varieties may be a factor in agronomic improvement 
but  can  also  hold  risks.  While  NPBTs  would  speed  up  adoption  of  new  varieties  obtained  by  these 
techniques,  having  an  impact  on  agricultural  ecosystems,  this  could  lead  to  additional  adjustment 
problems for biodiversity and associated ecosystem services. Similarly, cultivation of new varieties or 
species in currently unfarmed areas could alter the ecological characteristics of these environments. 
Yet biodiversity in both farmed and unfarmed areas supports ecological functions that are essential 
for  human  communities,  in  particular  regulating  and  supporting  ecosystemic  services  (Millennium 
50 
 

 
Ecosystem  Assessment,  200593).  Various  economic,  sociological  and  ecological  effects  on  farm 
production  and  food-processing  systems  may  be  expected,  depending  on  the  nature  of  the  traits 
modified  and/or  the  environments  where  the  new  varieties  are  introduced.  Given  the  range  of 
situations  that  might  occur,  it  would  be  useful,  if  new  varieties  contain  Novel  Traits,  for  these 
innovations to be monitored with regard to ecological, agro-ecological, economic and societal impact. 
 
 
6.  Management measures required to prevent and limit risks to health and the 
environment  associated  with  use  of  products  obtained  by  NPBTs  if  such 
risks are identified (Point 4 of the referral, in connection with Point 3) 

Assessment 
Management measures must be introduced in the light of the results of an assessment conducted on 
the  basis  of  the  proposals  set  out  in  Section  7  once  the  public  authorities  have  taken  appropriate 
action. 
 
Biomonitoring 
Management  measures  could  be  proposed  to  supplement  any  case-specific  monitoring,  crop 
containment  or  operator  protection  measures  that  might  prove  necessary  to  prevent  or  mitigate 
known or strongly suspected risks associated with unintended effects expressed in some of these new 
crop varieties. In some cases biomonitoring might be necessary. This would assume that the crops are 
recorded in a parcel register (the security of these parcels and of farmers being guaranteed by the 
public authorities) of the same kind as that introduced for the first Bt maize crops by the 1999 Outline 
Farming Act.94 This network could be extended to monitoring of unintended effects of cultivation of 
some new varieties.  
Local management of these new plants, with gradual roll-out over time and space, might be suggested 
to control the pace of agro-ecosystem change that might result from NPBTs. 
Screening  of  plants  expressing  effectors  could  be  done  as  part  of  screening  of  authorised  and 
unauthorised GMOs. 
 
Maintaining a modification-free gene pool 
The Scientific Committee notes that it is important to conserve pools of genetic resources unmodified 
by NPBTs. 
Lastly,  the  Scientific  Committee  points  out  that,  owing  to  the  complexity  of  the  issues  involved, 
advances in knowledge will make it possible to take better account of risks and their consequences.  
 
                                                           
93 http://www.millenniumassessment.org/en/ 
94 See glossary for further information. 
51 
 

 
7.  Proposal  of  intermediate  measures  between  the  provisions  of  the  EU 
catalogue  and  those  of  Directive  2001/18/EC  that  seem  advisable  for 
regulating use of  NPBTs on EU territory,  incorporating assessment of the 
socio-economic implications (in connection with Point 7). 

In  this  section,  procedures  and  the  need  for  mesocosms  were  discussed  during  the  Scientific 
Committee’s working sessions. 

 
7.1. Outline of the two systems in question 
A brief outline is provided below, for the purposes of comparison, of the registration procedures for a 
catalogue (Section 7.1.1, taking the Official French catalogue as an example) and the procedures arising 
out of Directive 2001/18/EC on GMOs (Section 7.1.2). 
 
7.1.1.  Registration in the Official French Catalogue 
There are two official catalogues at the national level in France: the Official French Catalogue of Plant 
Varieties, managed by the Technical Committee for Plant Breeding (CTPS), and the EU catalogue, which 
is the sum of national catalogues. Since the requirements for registration in a national catalogue may 
vary from one country to another, reference is here made to the Official French Catalogue. 
In France, marketing of varietal seed requires authorisation. This is provided through registration with 
the Official French Catalogue, the purpose of which is to guarantee users seed that is of sound and fair 
merchantable quality. Once a new variety has been produced, it must undergo a series of tests to check 
that  it  meets  the  three  requirements  of  distinctness,  uniformity  and  stability  (DUS),  as  well  as  the 
requirements  of  value  for  cultivation,  use  and  the  environment  (VCUE).  Thus  for  some  species, 
assessment of cultivation covers yield and growth characteristics, while assessment of use may cover 
protein and antinutrient content, and environmental assessment may cover resistance to certain pests 
to reduce pesticide use and resistance to abiotic stresses to reduce use of resources (water, nitrogen, 
phosphorus, etc.). The VCUE tests are specific to each species.  
By  way  of  example,  peas  will  be  assessed  for  seed  yield,  protein  content,  antitrypsin  factors, 
1000 kernel  weight,  cold  resistance  (winter  peas  only)  and  lodging  resistance,  while  wheat  will  be 
assessed for habit of growth, cold resistance, lodging and outgrowth resistance, suitability for early 
sowing, resistance to certain diseases (brown foot rot, rust (brown and yellow), glume blotch, eyespot), 
yield, end-use quality, processing characteristics, etc. 
 
7.1.2.  EU system specific to GM plants 
Directive 2001/18/EC regulates cultivation and placing on the market of genetically modified plants (if 
not excluded under Annex I B). An assessment of risks to health (allergenicity, toxicity and nutrient 
52 
 

 
composition) and to the environment (direct and indirect risks) must be carried out.95 It covers the 
transgene insertion event and allows authorisation of import or cultivation of plants containing such 
events whatever their genetic background (see glossary, Appendix VI).  
Thus  a  variety  obtained  by  a  conventional  breeding  technique  will  be  assessed  by  the  Technical 
Committee for Plant Breeding (CTPS) for registration in the Official French Catalogue, while a variety 
obtained by genetic engineering will be assessed first according to the criteria laid down by Directive 
2001/18/EC and then by the CTPS.  
 
7.2. Discussion of intermediate arrangements 
7.2.1.  Concept of difference/equivalence leaving aside the trait introduced 
Whether for DUS/VCUE assessment by the CTPS or assessment under Directive 2001/18/EC, the bulk 
of  assessment  consists  in  comparison  with  similar  unmodified  varieties.  However,  the  concepts  of 
difference and equivalence, leaving aside the new trait itself, are still complex. Which reference plants 
are  the  most  legitimate?  Which  exact  measurement  methods  should  be  used  to  decide  between 
difference  and  equivalence:  phenotypic  tests  (including  omics  tests96)?  What  range  of  genetic, 
phenotypic and environmental variation should be included in these assessments? 
The phenotypic testing carried out by the CTPS, although it cannot be exhaustive, has so far shown 
itself to be effective in terms of environmental and food safety. 
In future, multi-omics data analysis could be another means of deciding on difference or equivalence 
between two varieties. It might provide a better understanding of unforeseen direct and indirect risks. 
However, this field is not yet sufficiently developed in terms of standardisation of data, databases and 
designations to be used as a method of measuring at present. It might eventually supplement current 
phenotypic testing. 
 
7.2.2.  Procedures: A system based on case-by-case appraisal of the need for specific 
assessment 
The Scientific Committee suggests case-by-case appraisal according to the product obtained and the 
techniques used to obtain it, based on a declaration by the breeder. 
Thus the Scientific Committee suggests that the breeder should submit a descriptive document (a brief 
guide) to the assessment body. 
                                                           
95 In France the health assessment is carried out by the French Agency for Food, Environmental and Occupational 
Health and Safety (ANSES) and HCB and the environmental assessment by HCB. 
96  Omics  tests  include  tests  that  can  be  considered  phenotypic:  proteomic,  metabolomic,  high-throughput 
imaging, etc. 
53 
 

 
This  body will  then  assess  the  information  enabling plants  obtained  by  NPBTs to  be  identified  and 
assessed. The vade mecum should be included in the assessment dossier and would initially help to 
orient assessment of the genetic modification (Figure 5). 
This brief guide should provide the following information where applicable:  
o  Species, 
o  Identification of event and plant material prior to modification by an NPBT, 
o  Breeding method, 
o  Delivery method, 
o  Tissues targeted by modification, 
o  Trait(s) modified or introduced, 
o  Molecular characterisation of event, 
o  Target region sequences (before and after modification) and chromosome location, 
o  Presence or absence of components needed to use the technique, 
o  Phenotypic tests (phenotyping methods for trait modified or introduced), 
o  Impact on health and the environment, 
o  Any information that the breeder considers relevant to add. 
 
As  a  first  step,  this  descriptive  document  would  enable  the  genetic  modification  to  be  classified 
according to the framework set out below. It is at this stage that it must be determined whether a 
plant/product has been obtained by SDN-2 or SDN-3, for example. If effectors (components needed to 
carry out the technique) are present in the plant/product, it would de facto be considered a GMO.  
This assessment would also be based on a review of state-of-the-art knowledge about the product, an 
analysis of its impact in terms of the list of identified risks (e.g. risks/benefits of a modification of the 
biochemical composition of the plant or harvested plant parts) and study of the metabolic pathways 
affected by the genetic modification, which would provide a better understanding of the new trait’s 
expected  and  unforeseen  effects.  Consequently,  guidelines  for  the  applicant  should  be  available, 
specifying the information required for the final dossier in each case. 
The body that will determine the status of the genetic modification on the basis of the traceability 
document and the state of the art will be able to orient the assessment of the plant in line with the 
framework shown. 
As a second step, for plants/products not coming under assessment procedures laid down by existing 
regulations,  in-depth  appraisal  through  phenotypic  testing  (Figure  5)  would  be  designed  to  assess 
expected direct and indirect risks (to health and the environment) and (costs and) benefits associated 
with products obtained from the transformed plant and identified in the course of appraisal. 
54 
 


 
In the case of a Novel Trait97 in a product for food use, the criteria concerning toxicity and nutrient 
production may be similar to those laid down in the European Commission’s novel food regulation98 
(relating to a product’s toxicity and any nutritional imbalances resulting from its inclusion in a general 
diet), which are currently assessed by the French Agency for Food, Environmental and Occupational 
Health  and  Safety  (ANSES).  This  health  assessment  could  be  complemented  by  an  environmental 
assessment. 
 
 
Figure 5: Proposed intermediate options (in red) between the assessment laid down by Directive 2001/18/EC (in grey) and 
registration in the catalogue (in purple) for assessment and placing on the market of plants obtained by NPBTs. 
 
In  some  cases,  as  a  third  stage,  the  assessment  body  might  ask  for  supplementary  tests  to  clarify 
certain points or for post-registration stewardship measures.  
In a spirit of transparency such testing would also be designed to clarify the trait’s novelty in order to 
provide information for professionals and civil society. The novelty might not be associated with a risk, 
                                                           
97 See Section 1.3 for definition. 
98 http://ec.europa.eu/food/safety/novel_food/index_en.htm 
55 
 

 
but knowledge of it could affect choices by professionals and civil society as well as the conditions in 
which the innovation is used. 
In every case, registration in the Official French Catalogue would be necessary prior to placing on the 
market, followed by post-market biomonitoring in certain cases. 
 
7.3. Proposed assessment methods 
Novel traits 
The Scientific Committee observes that a number of potential risks listed for NPBTs appear to be no 
different from those associated with what is known as conventional breeding, which would support 
use of the same assessment process in both cases. A history of safe use should be taken into account 
to adjust assessments. 
Use of mesocosms for assessments prior to field release might be considered where relevant. 
 
Direct risks to human health 
These concern, firstly, the potential toxicity of novel components that might be present in the plant 
and  its  by-products  and  their  impact  in  terms  of  nutritional  balance,  in  combination  with  dietary 
exposure,  and,  secondly,  possible  allergic  phenomena  following  airborne  exposure  (pollen),  skin 
exposure (among workers in particular) or food exposure. These risks are common to all new varieties. 
The food-safety assessment strategy for NPBTs must take account of the specific features of each of 
these techniques. 
In this respect, the summary table of risks, their distinctive features and associated mitigation methods 
(Table V.1) provides pointers to two possible sets of standards: 
•  “Conventional breeding”, for which no particular requirements for food-safety assessment are 
contemplated, other than the health regulations applying to food in general. 
•  “Transgenesis”, for which specific provisions are planned, covering the three strands referred 
to above. 
Ten categories of potential risks arising out of unintended effects have been identified: 
Effector  persistence,  vector  persistence,  breeding  method,  unintended  genome  modification,  off-
target genome modifications due to delivery and regeneration, combination of targeted modifications, 
pleiotropy,  expression  of  short  interfering  RNA,  dissemination  of  short  interfering  RNA,  and 
unintended systemic and multigenerational effects. 
Two of these categories (effector persistence and combination of targeted modifications) are confined 
to SDNs, which must therefore demonstrate absence of effectors. 
For two others (vector persistence and breeding method), risks have also been identified concerning 
transgenesis, and the relevant provisions apply to these NPBTs.  
For the risks of short interfering RNA expression and dissemination, the provisions for transgenesis 
apply to cisgenesis/SDN-3 techniques. 
56 
 

 
As  for  risks  also  identified  for  conventional  breeding  or  random  mutants  (off-target  genome 
modifications  due  to  delivery  and  regeneration;  pleiotropy;  unintended  systemic  and 
multigenerational effects), and for non-specific risks, there would be no need in principle to consider 
special provisions.  
In  conclusion,  food  safety  provisions  for  NPBTs  must  be  based  on  those  for  the  two  ends  of  the 
spectrum, which are conventional breeding on the one hand and transgenesis on the other. 
 
Unintended modifications 
The HCB Scientific Committee suggests that when using site-directed nucleases, regions identified in 
silico as having sequences similar to that of the region targeted for modification should be sequenced 
whenever possible.  
 
Combination of targeted modifications 
Biomonitoring and specific testing systems could be used for the varieties concerned. The Scientific 
Committee recommends studying such applications on a case-by-case basis as and when they occur, 
since there are no examples of this type of modification to date. 
 
 
 
57 
 

 
Bibliography 
Ali,  Z.,  Abul-faraj,  A.,  Li,  L.,  Ghosh,  N.,  Piatek,  M.,  Mahjoub,  A.,  Aouida,  M.,  Piatek,  A.,  Baltes,  N.J., 
Voytas, D.F., et al. (2015). Efficient Virus-Mediated Genome Editing in Plants Using the CRISPR/Cas9 
System. Mol. Plant 8, 1288–1291. 
Anderson, J.E., Michno, J.-M., Kono, T.J.Y., Stec, A.O., Campbell, B.W., Curtin, S.J., and Stupar, R.M. 
(2016).  Genomic  variation  and  DNA  repair  associated  with  soybean  transgenesis:  a  comparison  to 
cultivars and mutagenized plants. BMC Biotechnol. 16
Andersson, M.S., and de Vicente, M.C. (2010). Gene flow between crops and their wild relatives (Johns 
Hopkins University Press). 
Asano,  Y.,  Otsuki,  Y.,  and  Ugaki,  M.  (1991).  Electroporation-mediated  and  silicon  carbide  fiber-
mediated DNA delivery in Agrostis alba L. (Redtop). Plant Sci. 79, 247–252. 
Auer, C., and Frederick, R. (2009). Crop improvement using small RNAs: applications and predictive 
ecological risk assessments. Trends Biotechnol. 27, 644–651. 
Bairu,  M.W.,  Aremu,  A.O.,  and  Van  Staden,  J.  (2011).  Somaclonal  variation  in  plants:  causes  and 
detection methods. Plant Growth Regul. 63, 147–173. 
Baltes, N.J., Gil-Humanes, J., Cermak, T., Atkins, P.A., and Voytas, D.F. (2014). DNA replicons for plant 
genome engineering. Plant Cell 26, 151–163. 
Bechtold,  N.,  Ellis,  J.,  and  Pelletier,  G.  (1993).  In  planta  Agrobacterium  mediated  gene  transfer  by 
infiltration of  adult  Arabidopsis  thaliana  plants.  Comptes  Rendus  Académie  Sci.  Sér.  3  Sci.  Vie  316
1194–1199. 
Bohan, D.A., Boffey, C.W.., Brooks, D.R., Clark, S.J., Dewar, A.M., Firbank, L.G., Haughton, A.J., Hawes, 
C., Heard, M.S., May, M.J., et al. (2005). Effects on weed and invertebrate abundance and diversity of 
herbicide management in genetically modified herbicide-tolerant winter-sown oilseed rape. Proc. R. 
Soc. B Biol. Sci. 272, 463–474. 
Bohanec, M., Boshkoska, B.M., Prins, T.W., and Kok, E.J. (2017). SIGMO: A decision support System for 
Identification of genetically modified food or feed products. Food Control 71, 168–177. 
Bonny,  S.  (2008).  Genetically  modified  glyphosate-tolerant  soybean  in  the  USA:  adoption  factors, 
impacts and prospects. A review. Agron. Sustain. Dev. 28, 21–32. 
Bonny,  S.  (2016).  Genetically  Modified  Herbicide-Tolerant  Crops,  Weeds,  and  Herbicides:  Overview 
and Impact. Environ. Manage. 57, 31–48. 
Breyer, D., Kopertekh, L., and Reheul, D. (2014). Alternatives to Antibiotic Resistance Marker Genes for 
In Vitro Selection of Genetically Modified Plants – Scientific Developments, Current Use, Operational 
Access and Biosafety Considerations. Crit. Rev. Plant Sci. 33, 286–330. 
Brunaud, V., Balzergue, S., Dubreucq, B., Aubourg, S., Samson, F., Chauvin, S., Bechtold, N., Cruaud, C., 
DeRose,  R., Pelletier,  G.,  et  al.  (2002).  T-DNA  integration  into  the  Arabidopsis  genome  depends  on 
sequences of pre-insertion sites. EMBO Rep. 3, 1152–1157. 
van den Bulk, R.W., Löffler, H.J., Lindhout, W.H., and Koornneef, M. (1990). Somaclonal variation in 
tomato:  effect  of  explant  source  and  a  comparison  with  chemical  mutagenesis.  TAG  Theor.  Appl. 
Genet. Theor. Angew. Genet. 80, 817–825. 
Burdon, J.J., Barrett, L.G., Rebetzke, G., and Thrall, P.H. (2014). Guiding deployment of resistance in 
cereals using evolutionary principles. Evol. Appl. 7, 609–624. 
Cambray, G., Mutalik, V.K., and Arkin, A.P. (2011). Toward rational design of bacterial genomes. Curr. 
Opin. Microbiol. 14, 624–630. 
58 
 

 
Cantos,  C.,  Francisco,  P.,  Trijatmiko,  K.R.,  Slamet-Loedin,  I.,  and  Chadha-Mohanty,  P.K.  (2014). 
Identification  of  “safe  harbor”  loci  in  indica  rice  genome  by  harnessing  the  property  of  zinc-finger 
nucleases to induce DNA damage and repair. Front. Plant Sci. 5, 302. 
Castle, L.A. (2004). Discovery and Directed Evolution of a Glyphosate  Tolerance  Gene. Science  304
1151–1154. 
Čermák,  T.,  Baltes,  N.J.,  Čegan,  R.,  Zhang,  Y.,  and  Voytas,  D.F.  (2015).  High-frequency,  precise 
modification of the tomato genome. Genome Biol. 16
Chandler,  C.H.,  Chari,  S.,  and  Dworkin,  I.  (2013).  Does  your  gene  need  a  background  check?  How 
genetic background impacts the analysis of mutations, genes, and evolution. Trends Genet. 29, 358–
366. 
Chawla, H.S. (2009). Introduction to plant biotechnology (Enfield, NH: Science Publishers). 
Chèvre, A.M., Eber, F., Baranger, A., and Renard, M. (1997). Gene flow from transgenic crops. Nature 
389, 924–924. 
De Vries, F.T., Bracht Jørgensen, H., Hedlund, K., and Bardgett, R.D. (2015). Disentangling plant and soil 
microbial controls on carbon and nitrogen loss in grassland mesocosms. J. Ecol. 103, 629–640. 
Dempewolf, H., Hodgins, K.A., Rummell, S.E., Ellstrand, N.C., and Rieseberg, L.H. (2012). Reproductive 
isolation during domestication. Plant Cell 24, 2710–2717. 
Devos, Y., Meihls, L.N., Kiss, J., and Hibbard, B.E. (2013). Resistance evolution to the first generation of 
genetically modified Diabrotica-active Bt-maize events by western corn rootworm: management and 
monitoring considerations. Transgenic Res. 22, 269–299. 
Dixon,  D.P.,  McEwen,  A.G.,  Lapthorn,  A.J.,  and  Edwards,  R.  (2003).  Forced  evolution  of  a  herbicide 
detoxifying glutathione transferase. J. Biol. Chem. 278, 23930–23935. 
EC  (2003).  Regulation  (EC)  No  1830/2003  of  the  European  Parliament  and  of  the  Council  of  22 
September 2003 concerning the traceability and labelling of genetically modified organisms and the 
traceability of food and feed products produced from genetically modified organisms and amending 
Directive 2001/18/EC. Off. J. Eur. Union L268, 24–28. 
EFSA (2011). Scientific Opinion on guidance on the Post-Market Environmental Monitoring (PMEM) of 
genetically modified plants. EFSA J. 9 (8): 2316, 40 pp. 
EFSA, P. on G.M.O. (GMOs) (2014). Scientific Opinion on the use of existing environmental surveillance 
networks  to  support  the  post-market  environmental  monitoring  of  genetically  modified  plants: 
Scientific Opinion on the use of existing ESNs to support the PMEM of GMPs. EFSA J. 12, 3883. 
Esvelt, K.M., and Wang, H.H. (2013). Genome-scale engineering for systems and synthetic biology. Mol. 
Syst. Biol. 9, 641. 
Fu,  Y.,  Foden,  J.A.,  Khayter,  C.,  Maeder, M.L.,  Reyon,  D.,  Joung,  J.K.,  and  Sander,  J.D.  (2013).  High-
frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 
31, 822–826. 
Garnier, A., and Lecomte, J. (2006). Using a spatial and stage-structured invasion model to assess the 
spread of feral populations of transgenic oilseed rape. Ecol. Model. 194, 141–149. 
Garnier, A., Deville, A., and Lecomte, J. (2006). Stochastic modelling of feral plant populations with 
seed immigration and road verge management. Ecol. Model. 197, 373–382. 
Garnier, A., Pivard, S., and Lecomte, J. (2008). Measuring and modelling anthropogenic secondary seed 
dispersal along roadverges for feral oilseed rape. Basic Appl. Ecol. 9, 533–541. 
59 
 

 
Gauffreteau, A., D’Orchymond, M., Pontet, C., and Debaeke, P. (2016). Can Genotype x Environment 
Management Interactions (GEMI) be predicted in sunflower multi-environment trials? In Proc., (Edirne 
(Turkey)), p. 
Gauffreteau, A., Grignon, G., Pachot, P., Lorgeou, J., Piraux, F., Maupas, F., Escriou, H., Pontet, C., and 
Salvi, F. (2015). Assessing the predictive accuracy of various statistical methods (PLS, random forest 
and  factorial  regression)  that  use  environmental  covariates  to  model  genotype  x  environment 
interactions in multi-environment trials. Biultyn Oceny Odmian 34
Germana,  M.A.,  and  Lambardi,  M.  (2016).  In  vitro  embryogenesis  in  higher  plants  (New  York,  NY: 
Humana Press). 
Gleave, A.P., Mitra, D.S., Mudge, S.R., and Morris, B.A. (1999). Selectable marker-free transgenic plants 
without  sexual  crossing:  transient  expression  of  cre  recombinase  and  use  of  a  conditional  lethal 
dominant gene. Plant Mol. Biol. 40, 223–235. 
Gouesnard,  B.,  Chastanet,  M.,  Tollon-Cordet,  C.,  Dubreuil,  P.,  Boyat,  A.,  and  Charcosset,  A.  (2005). 
Etude  de  la  diversité  génétique  du  maïs  en  Europe :  analyse  d’ADN  ancien  à  partir  d’échantillons 
d’herbier et confrontation avec l’analyse moléculaire à grande échelle de collections de populations. 
Genetic  diversity  of  maize  in  Europe :  molecular  analysis  of  ancient  DNA  from  herbariums  and 
comparison  with  molecular  analysis  of  a  large  collection  of  populations.  In  Un  Dialogue  Pour  La 
Diversité Génétique, (Lyon, FRA Paris, FRA: Bureau des Ressources Génétiques), pp. 345–356. 
Hall, M.C., Dworkin, I., Ungerer, M.C., and Purugganan, M. (2007). Genetics of microenvironmental 
canalization in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 13717–13722. 
Hendel, A., Fine, E.J., Bao, G., and Porteus, M.H. (2015). Quantifying on- and off-target genome editing. 
Trends Biotechnol. 33, 132–140. 
Heslot, N., Akdemir, D., Sorrells, M.E., and Jannink, J.-L. (2014). Integrating environmental covariates 
and  crop  modeling  into  the  genomic  selection  framework  to  predict  genotype  by  environment 
interactions. Theor. Appl. Genet. 127, 463–480. 
Holck,  A.L.,  Drømtorp,  S.M.,  and  Heir,  E.  (2009).  Quantitative,  multiplex  ligation-dependent  probe 
amplification for the determination of eight genetically modified maize events. Eur. Food Res. Technol. 
230, 185–194. 
Holst-Jensen,  A.,  Bertheau,  Y.,  de  Loose,  M.,  Grohmann,  L.,  Hamels,  S.,  Hougs,  L.,  Morisset,  D., 
Pecoraro, S., Pla, M., Van den Bulcke, M., et al. (2012). Detecting un-authorized genetically modified 
organisms (GMOs) and derived materials. Biotechnol. Adv. 30, 1318–1335. 
Hsu, P.D., Scott, D.A., Weinstein, J.A., Ran, F.A., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E.J., Wu, X., 
Shalem, O., et al. (2013). DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31
827–832. 
Jiang, C., Mithani, A., Gan, X., Belfield, E.J., Klingler, J.P., Zhu, J.-K., Ragoussis, J., Mott, R., and Harberd, 
N.P. (2011). Regenerant Arabidopsis Lineages Display a Distinct Genome-Wide Spectrum of Mutations 
Conferring Variant Phenotypes. Curr. Biol. 21, 1385–1390. 
Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentier, E. (2012). A programmable 
dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816–821. 
Jones, J.D.G., Witek, K., Verweij, W., Jupe, F., Cooke, D., Dorling, S., Tomlinson, L., Smoker, M., Perkins, 
S., and Foster, S. (2014). Elevating crop disease resistance with cloned genes. Philos. Trans. R. Soc. B 
Biol. Sci. 369, 20130087–20130087. 
Kaeppler,  H.F.,  Gu,  W.,  Somers,  D.A.,  Rines,  H.W.,  and  Cockburn,  A.F.  (1990).  Silicon  carbide  fiber-
mediated DNA delivery into plant cells. Plant Cell Rep. 9, 415–418. 
60 
 

 
Kaeppler,  S.M.,  Kaeppler,  H.F.,  and  Rhee,  Y.  (2000).  Epigenetic  aspects  of  somaclonal  variation  in 
plants. Plant Mol. Biol. 43, 179–188. 
Kil, E.-J., Kim, S., Lee, Y.-J., Byun, H.-S., Park, J., Seo, H., Kim, C.-S., Shim, J.-K., Lee, J.-H., Kim, J.-K., et al. 
(2016). Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV-IL): a seed-transmissible geminivirus in tomatoes. Sci. Rep. 
6, 19013. 
Kim, J., and Kim, J.-S. (2016). Bypassing GMO regulations with CRISPR gene editing. Nat. Biotechnol. 
34, 1014–1015. 
Kimura, M. (1984). The neutral theory of molecular evolution (Cambridge University Press). 
Kole, C., Muthamilarasan, M., Henry, R., Edwards, D., Sharma, R., Abberton, M., Batley, J., Bentley, A., 
Blakeney,  M.,  Bryant,  J.,  et  al.  (2015).  Application  of  genomics-assisted  breeding  for  generation  of 
climate resilient crops: progress and prospects. Front. Plant Sci. 6, 563. 
Krishna,  H.,  Alizadeh,  M.,  Singh,  D.,  Singh,  U.,  Chauhan,  N.,  Eftekhari,  M.,  and  Sadh,  R.K.  (2016). 
Somaclonal variations and their applications in horticultural crops improvement. 3 Biotech 6
Lamichhane, J.R., Devos, Y., Beckie, H.J., Owen, M.D.K., Tillie, P., Messéan, A., and Kudsk, P. (2016). 
Integrated weed management systems with herbicide-tolerant crops in the European Union: lessons 
learnt from home and abroad. Crit. Rev. Biotechnol. 1–17. 
Liang, P., Xu, Y., Zhang, X., Ding, C., Huang, R., Zhang, Z., Lv, J., Xie, X., Chen, Y., Li, Y., et al.  (2015). 
CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes. Protein Cell. 
Lin,  Y.,  Fine,  E.J.,  Zheng,  Z.,  Antico,  C.J.,  Voit,  R.A.,  Porteus,  M.H.,  Cradick,  T.J.,  and  Bao,  G.  (2014). 
SAPTA: a new design tool for improving TALE nuclease activity. Nucleic Acids Res. 42, e47. 
Liu, D., Hu, R., Palla, K.J., Tuskan, G.A., and Yang, X. (2016). Advances and perspectives on the use of 
CRISPR/Cas9 systems in plant genomics research. Curr. Opin. Plant Biol. 30, 70–77. 
Lynch, M. (2010). Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26, 345–352. 
Machczyńska, J., Zimny, J., and Bednarek, P.T. (2015). Tissue culture-induced genetic and epigenetic 
variation in triticale (× Triticosecale spp. Wittmack ex A. Camus 1927) regenerants. Plant Mol. Biol. 89
279–292. 
Martín-Hernández,  A.M.,  and  Baulcombe,  D.C.  (2008).  Tobacco  rattle  virus  16-kilodalton  protein 
encodes a suppressor of RNA silencing that allows transient viral entry in meristems. J. Virol. 82, 4064–
4071. 
Mba, C. (2013). Induced Mutations Unleash the Potentials of Plant Genetic Resources for Food and 
Agriculture. Agronomy 3, 200–231. 
McCallum, C.M., Comai, L., Greene, E.A., and Henikoff, S. (2000). Targeting induced local lesions IN 
genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439–442. 
Molesini,  B.,  Pii,  Y.,  and  Pandolfini,  T.  (2012).  Fruit  improvement  using  intragenesis  and  artificial 
microRNA. Trends Biotechnol. 30, 80–88. 
Newbold,  T.,  Hudson,  L.N.,  Hill,  S.L.L.,  Contu,  S.,  Lysenko,  I.,  Senior,  R.A.,  Börger,  L.,  Bennett,  D.J., 
Choimes, A., Collen, B., et al. (2015). Global effects of land use on local terrestrial biodiversity. Nature 
520, 45–50. 
O’Doherty, K.C., Neufeld, J.D.,  Brinkman, F.S.L., Gardner, H., Guttman, D.S., and Beiko, R.G. (2014). 
Opinion: Conservation and stewardship of the human microbiome. Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 14312–
14313. 
61 
 

 
Ong-Abdullah, M., Ordway, J.M., Jiang, N., Ooi, S.-E., Kok,  S.-Y., Sarpan, N., Azimi, N., Hashim, A.T., 
Ishak,  Z.,  Rosli,  S.K.,  et  al.  (2015).  Loss  of  Karma  transposon  methylation  underlies  the mantled 
somaclonal variant of oil palm. Nature 525, 533–537. 
Ossowski, S., Schneeberger, K., Lucas-Lledo, J.I., Warthmann, N., Clark, R.M., Shaw, R.G., Weigel, D., 
and  Lynch,  M.  (2010). The  Rate  and Molecular  Spectrum of  Spontaneous Mutations  in  Arabidopsis 
thaliana. Science 327, 92–94. 
Pacher, M., Schmidt-Puchta, W., and Puchta, H. (2007). Two unlinked double-strand breaks can induce 
reciprocal  exchanges  in  plant  genomes  via  homologous  recombination  and  nonhomologous  end 
joining. Genetics 175, 21–29. 
Parry,  M.A.J.,  Madgwick,  P.J.,  Bayon,  C.,  Tearall,  K.,  Hernandez-Lopez,  A.,  Baudo,  M.,  Rakszegi,  M., 
Hamada, W., Al-Yassin, A., Ouabbou, H., et al. (2009). Mutation discovery for crop improvement. J. 
Exp. Bot. 60, 2817–2825. 
Pattanayak,  V.,  Lin,  S.,  Guilinger,  J.P.,  Ma,  E.,  Doudna,  J.A.,  and  Liu,  D.R.  (2013).  High-throughput 
profiling  of  off-target  DNA  cleavage  reveals  RNA-programmed  Cas9  nuclease  specificity.  Nat. 
Biotechnol. 31, 839–843. 
Peele, C., Jordan, C.V., Muangsan, N., Turnage, M., Egelkrout, E., Eagle, P., Hanley-Bowdoin, L., and 
Robertson, D. (2001). Silencing of a meristematic gene using geminivirus-derived vectors. Plant J. Cell 
Mol. Biol. 27, 357–366. 
Peterson, B.A., Haak, D.C., Nishimura, M.T., Teixeira, P.J.P.L., James, S.R., Dangl, J.L., and Nimchuk, Z.L. 
(2016). Genome-Wide Assessment of Efficiency and Specificity in CRISPR/Cas9 Mediated Multiple Site 
Targeting in Arabidopsis. PloS One 11, e0162169. 
Petolino, J.F., and Arnold, N.L. (2009). Whiskers-mediated maize transformation. Methods Mol. Biol. 
Clifton NJ 526, 59–67. 
Petrillo, M., Angers-Loustau, A., Henriksson, P., Bonfini, L., Patak, A., and Kreysa, J. (2015). JRC GMO-
Amplicons: a collection of nucleic acid sequences related to genetically modified organisms. Database 
2015, bav101. 
Phillips, P.C. (2008). Epistasis — the essential role of gene interactions in the structure and evolution 
of genetic systems. Nat. Rev. Genet. 9, 855–867. 
Qi, W., Zhu, T., Tian, Z., Li, C., Zhang, W., and Song, R. (2016). High-efficiency CRISPR/Cas9 multiplex 
gene editing using the glycine tRNA-processing system-based strategy in maize. BMC Biotechnol. 16
58. 
Raitskin, O., and Patron, N.J. (2016). Multi-gene engineering in plants with RNA-guided Cas9 nuclease. 
Curr. Opin. Biotechnol. 37, 69–75. 
Ramesh, S.V. (2013). Non-coding RNAs in Crop Genetic Modification: Considerations and Predictable 
Environmental Risk Assessments (ERA). Mol. Biotechnol. 
Rao, A.G. (2008). The outlook for protein engineering in crop improvement. Plant Physiol. 147, 6–12. 
Reboud, X.,  Gabas, S., Borgy, B., Bonneau, M., Délos, M., and Fried, G. (2013). Que nous disent les 
réseaux d’observatoires sur les réactions de la flore adventice aux évolutions des pratiques agricoles ? 
Innov. Agron. 28, 127–140. 
Regnault-Roger,  C.  (2014).  Produits  de  protection  des  plantes  innovation  et  sécurité  pour  une 
agriculture durable (Paris: Tec & Doc : Lavoisier). 
Rhee, Y., Sekhon, R.S., Chopra, S., and Kaeppler, S. (2010). Tissue culture-induced novel epialleles of a 
Myb transcription factor encoded by pericarp color1 in maize. Genetics 186, 843–855. 
62 
 

 
Ricroch, A.E., and Hénard-Damave, M.-C. (2015). Next biotech plants: new traits, crops, developers and 
technologies for addressing global challenges. Crit. Rev. Biotechnol. 1–16. 
Roles,  A.J.,  Rutter,  M.T.,  Dworkin,  I.,  Fenster,  C.B.,  and  Conner,  J.K.  (2016).  Field  measurements  of 
genotype  by  environment  interaction  for  fitness  caused  by  spontaneous  mutations  in  Arabidopsis 
thaliana. Evol. Int. J. Org. Evol. 70, 1039–1050. 
Rosa, S.F., Gatto, F., Angers-Loustau, A., Petrillo, M., Kreysa, J., and Querci, M. (2016). Development 
and applicability of a ready-to-use PCR system for GMO screening. Food Chem. 201, 110–119. 
Schaeffer,  S.M.,  and  Nakata,  P.A.  (2015).  CRISPR/Cas9-mediated  genome  editing  and  gene 
replacement in plants: Transitioning from lab to field. Plant Sci. Int. J. Exp. Plant Biol. 240, 130–142. 
Schouten, H.J., and Jacobsen, E. (2007). Are Mutations in Genetically Modified Plants Dangerous? J. 
Biomed. Biotechnol. 2007, 1–2. 
Simpson, R.B., Spielmann, A., Margossian, L., and McKnight, T.D. (1986). A disarmed binary vector from 
Agrobacterium  tumefaciens  functions  in  Agrobacterium  rhizogenes:  Frequent  co-transformation  of 
two distinct T-DNAs. Plant Mol. Biol. 6, 403–415. 
Smith, D.R.,  Hooker,  A.L., Lim,  S.M.,  and  Beckett,  J.B.  (1971). Disease  Reaction of Thirty  Sources  of 
Cytoplasmiic Male-Sterile Corn to Helminthosporium Maydis Race T1. Crop Sci. 11, 772. 
Srivastava, V., and Ow, D.W. (2003). Rare instances of Cre-mediated deletion product maintained in 
transgenic wheat. Plant Mol. Biol. 52, 661–668. 
Stelpflug, S.C., Eichten, S.R., Hermanson, P.J., Springer, N.M., and Kaeppler, S.M. (2014). Consistent 
and heritable  alterations of DNA methylation are induced by tissue culture in maize. Genetics  198
209–218. 
Stewart, R.I.A., Dossena, M., Bohan, D.A., Jeppesen, E., Kordas, R.L., Ledger, M.E., Meerhoff, M., Moss, 
B.,  Mulder,  C.,  Shurin,  J.B.,  et  al.  (2013).  Mesocosm  Experiments  as  a  Tool  for  Ecological  Climate-
Change Research. In Advances in Ecological Research, (Elsevier), pp. 71–181. 
Stukenbrock,  E.H.,  and  McDonald,  B.A.  (2008).  The  origins  of  plant  pathogens  in  agro-ecosystems. 
Annu. Rev. Phytopathol. 46, 75–100. 
Suprasanna, P., Mirajkar, S.J., and Bhagwat, S.G. (2015). Induced Mutations and Crop Improvement. In 
Plant Biology and Biotechnology, B. Bahadur, M. Venkat Rajam, L. Sahijram, and K.V. Krishnamurthy, 
eds. (New Delhi: Springer India), pp. 593–617. 
Tabashnik, B.E., Brévault, T., and Carrière, Y. (2013). Insect resistance to Bt crops: lessons from the first 
billion acres. Nat. Biotechnol. 31, 510–521. 
Tadele, Z., Mba, C., and Till, B.J. (2010). TILLING for Mutations in Model Plants and Crops. In Molecular 
Techniques in Crop Improvement, S.M. Jain, and D.S. Brar, eds. (Dordrecht: Springer Netherlands), pp. 
307–332. 
Tatum, L.A. (1971). The Southern Corn Leaf Blight Epidemic. Science 171, 1113–1116. 
Terakawa,  T.,  Hasegawa,  H.,  and  Yamaguchi,  M.  (2005).  Efficient  Whisker-mediated  Gene 
Transformation in a Combination with Supersonic Treatment. BreedingScience 55, 465–468. 
Traidl-Hoffmann, C., Jakob, T., and Behrendt, H. (2009). Determinants of allergenicity. J. Allergy Clin. 
Immunol. 123, 558–566. 
Tsai, S.Q., Zheng, Z., Nguyen, N.T., Liebers, M., Topkar, V.V., Thapar, V., Wyvekens, N., Khayter, C., 
Iafrate, A.J., Le, L.P., et al. (2015). GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by 
CRISPR-Cas nucleases. Nat. Biotechnol. 33, 187–197. 
63 
 

 
Ülker, B., Li, Y., Rosso, M.G., Logemann, E., Somssich, I.E., and Weisshaar, B. (2008). T-DNA–mediated 
transfer of Agrobacterium tumefaciens chromosomal DNA into plants. Nat. Biotechnol. 26, 1015–1017. 
Vigouroux,  Y.,  Barnaud,  A.,  Scarcelli,  N.,  and  Thuillet,  A.-C.  (2011).  Biodiversity,  evolution  and 
adaptation of cultivated crops. C. R. Biol. 334, 450–457. 
Wakeley, J. (2009). Coalescent theory: an introduction (Greenwood Village, Colo: Roberts). 
Wang, Y., Cheng, X., Shan, Q., Zhang, Y., Liu, J., Gao, C., and Qiu, J.-L. (2014). Simultaneous editing of 
three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat. 
Biotechnol. 32, 947–951. 
Watterson,  G.A.  (1975).  On  the  number  of  segregating  sites  in  genetical  models  without 
recombination. Theor. Popul. Biol. 7, 256–276. 
Wei, F.-J., Kuang, L.-Y., Oung, H.-M., Cheng, S.-Y., Wu, H.-P., Huang, L.-T., Tseng, Y.-T., Chiou, W.-Y., 
Hsieh-Feng,  V.,  Chung,  C.-H.,  et  al.  (2016).  Somaclonal  variation  does  not  preclude  the  use  of  rice 
transformants for genetic screening. Plant J. 85, 648–659. 
Whitney, K.D., Ahern, J.R., Campbell, L.G., Albert, L.P., and King, M.S. (2010). Patterns of hybridization 
in plants. Perspect. Plant Ecol. Evol. Syst. 12, 175–182. 
Wolfarth,  F.,  Schrader,  S.,  Oldenburg,  E.,  and  Brunotte,  J.  (2016).  Mycotoxin  contamination  and  its 
regulation  by  the  earthworm  species  Lumbricus  terrestris  in  presence  of  other  soil  fauna  in  an 
agroecosystem. Plant Soil 402, 331–342. 
Woo, J.W., Kim, J., Kwon, S.I., Corvalán, C., Cho, S.W., Kim, H., Kim, S.-G., Kim, S.-T., Choe, S., and Kim, 
J.-S. (2015). DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. 
Nat. Biotechnol. 33, 1162–1164. 
Woodruff, L.B.A., and Gill, R.T. (2011). Engineering genomes in multiplex. Curr. Opin. Biotechnol. 22
576–583. 
Xu,  P.,  Zhang, Y.,  Kang, L.,  Roossinck,  M.J.,  and Mysore, K.S.  (2006).  Computational  estimation  and 
experimental  verification  of  off-target  silencing  during  posttranscriptional  gene  silencing  in  plants. 
Plant Physiol. 142, 429–440. 
Yau, Y.-Y., and Stewart, C.N. (2013). Less is more: strategies to remove marker genes from transgenic 
plants. BMC Biotechnol. 13, 36. 
Yee, J.-K. (2016). Off-target effects of engineered nucleases. FEBS J. 283, 3239–3248. 
Yin, K., Han, T., Liu, G., Chen, T., Wang, Y., Yu, A.Y.L., and Liu, Y. (2015). A geminivirus-based guide RNA 
delivery system for CRISPR/Cas9 mediated plant genome editing. Sci. Rep. 5, 14926. 
Younis,  A.,  Siddique,  M.I.,  Kim,  C.-K.,  and  Lim,  K.-B.  (2014).  RNA  Interference  (RNAi)  Induced  Gene 
Silencing: A Promising Approach of Hi-Tech Plant Breeding. Int. J. Biol. Sci. 10, 1150–1158. 
Yuan, L., Kurek, I., English, J., and Keenan, R. (2005). Laboratory-directed protein evolution. Microbiol. 
Mol. Biol. Rev. MMBR 69, 373–392. 
 
 
 
64 
 


 
Annexe I Saisine 
 
 
65 
 


 
 
 
66 
 


 
67 
 


 
Annexe II Lettre de cadrage 
68 
 


 
 
69 
 


 
 
70 
 

 
Annexe III Liste des membres du Groupe de Travail 
 
Le rapport du groupe de travail a été élaboré à partir des discussions qui ont eu lieu au sein du groupe 
de travail du CS du HCB entre le 29 mars et le 15 juin 2016 sous la responsabilité du rapporteur du CS 
Marie-Bérengère Troadec. 
Le  groupe  de  travail  du  CS  du  HCB  est  un  groupe  pluridisciplinaire  composé  de  personnalités 
scientifiques choisies pour leur expertise afin de répondre aux questions posées dans la saisine. Par 
ordre alphabétique des noms de famille, le GT du CS du HCB est compose de : 
Frédérique  Angevin,  Claude  Bagnis,  Cécile  Collonnier,  Marie-Anne  Félix,  Jeanne  Garric,  Philippe 
Guerche, Valérie Le Corre, Thierry Orsière, Michel Renard et Marie-Bérengère Troadec.  
Le  groupe  de  travail  a  auditionné  deux  experts  externes  ayant  une  expertise  dans  le  domaine  de 
l’épigénétique et des effets hors-cibles des CRISPR/Cas9 : 
Vincent Colot et Jean-Paul Concordet. 
Ces deux experts ont été entendus dans le cadre des travaux du groupe de travail mais n’ont pas pris 
part à la rédaction du rapport ni aux discussions qui ont eu lieu au sein du groupe de travail.  
 
 
71 
 

 
Annexe IV Liste des membres du comité scientifique  
Séance plénière du 13 juillet (matin) 
présents :  
Jean-Christophe Pagès, Président, Claudine Franche, Vice-présidente, Pascal Boireau, Vice-président,  
et par ordre alphabétique des noms de famille :  
Claude  Bagnis,  Bruno  Chauvel,  Denis  Couvet,  Elie  Dassa,  Hubert  de  Verneuil,  Joël  Guillemain, 
Guillermina  Hernandez-Raquet,  Bernard  Klonjkowski,  Olivier  Lemaire,  Didier  Lereclus,  Rémi 
Maximilien,  Nadia  Naffakh,  Didier  Nègre,  Sergio  Ochatt,  Catherine  Regnault-Roger,  Michel  Renard, 
Patrick Saindrenan, Pascal Simonet, Marie-Bérengère Troadec, Bernard Vaissière, Jean-Luc Vilotte.  
- absents, représentés :  
Philippe Guerche, Eliane Meurs.  
- absents, excusés :  
Avner Bar Hen, Marie-Anne Barny, Philippe Berny, Yves Bertheau (démissionnaire), Thierry Brévault, 
Nathalie Eychenne, André Jestin, Marc Lavielle, Valérie Le Corre, Jean-Louis Noyer, Daniel Parzy. 
Séance plénière du 13 juillet (après-midi) 
présents :  
Jean-Christophe Pagès, Président, Pascal Boireau, Vice-président,  
et par ordre alphabétique des noms de famille :  
Claude  Bagnis,  Bruno  Chauvel,  Denis  Couvet,  Elie  Dassa,  Hubert  de  Verneuil,  Joël  Guillemain, 
Guillermina  Hernandez-Raquet,  Didier  Lereclus,  Rémi  Maximilien,  Didier  Nègre,  Sergio  Ochatt, 
Catherine  Regnault-Roger,  Michel  Renard,  Patrick  Saindrenan,  Pascal  Simonet,  Marie-Bérengère 
Troadec, Bernard Vaissière, Jean-Luc Vilotte.  
- absents, représentés :  
Claudine Franche, Philippe Guerche, Eliane Meurs.  
- absents, excusés :  
Avner Bar Hen, Marie-Anne Barny, Philippe Berny, Yves Bertheau (démissionnaire), Thierry Brévault, 
Nathalie Eychenne, André Jestin, Bernard Klonjkowski, Marc Lavielle, Valérie Le Corre, Nadia Naffakh 
Jean-Louis Noyer, Daniel Parzy. 
 
Séance plénière du 21 septembre (matin) 
présents :  
Jean-Christophe Pagès, Président, Claudine Franche, Vice-présidente, Pascal Boireau, Vice-président, 
et par ordre alphabétique des noms de famille : 
 Claude Bagnis, Avner Bar Hen, Marie-Anne Barny, Bruno Chauvel, Denis Couvet, Elie Dassa, Hubert de 
Verneuil, Joël Guillemain, Guillermina Hernandez-Raquet, Bernard Klonjkowski, Marc Lavielle, Valérie 
72 
 

 
Le  Corre,  Didier  Lereclus,  Rémi  Maximilien,  Eliane  Meurs,  Nadia  Naffakh,  Didier  Nègre,  Jean-  Louis 
Noyer, Sergio Ochatt, Catherine Regnault-Roger, Michel Renard, Patrick Saindrenan, Pascal Simonet, 
Marie-Bérengère Troadec, Jean-Luc Vilotte. 
- absents, représentés :  
Thierry Brévault, Philippe Guerche, Olivier Lemaire.  
- absents, excusés :  
Philippe  Berny,  Yves  Bertheau  (démissionnaire),  Nathalie  Eychenne,  André  Jestin,  Daniel  Parzy, 
Bernard Vaissière. 
 
Séance plénière du 21 septembre (après midi) 
- présents : 
Jean-Christophe Pagès, Président, Claudine Franche, Vice-présidente,  
et par ordre alphabétique des noms de famille :  
Claude  Bagnis,  Marie-Anne  Barny,  Bruno  Chauvel,  Denis  Couvet,  Joël  Guillemain,  Guillermina 
Hernandez-Raquet,  Bernard  Klonjkowski,  Olivier  Lemaire,  Didier  Lereclus,  Rémi  Maximilien,  Nadia 
Naffakh, Jean-Louis Noyer, Sergio Ochatt, Michel Renard, Patrick Saindrenan, Pascal Simonet, Marie- 
Bérengère Troadec, Jean-Luc Vilotte.  
- absents, représentés :  
Pascal Boireau, Elie Dassa, Hubert de Verneuil, Philippe Guerche, Eliane Meurs, Catherine Regnault-
Roger, Bernard Vaissière.  
- absents, excusés :  
Avner Bar Hen, Philippe Berny, Yves Bertheau (démissionnaire), Thierry Brévault, Nathalie Eychenne, 
André Jestin, Marc Lavielle, Valérie Le Corre, Didier Nègre, Daniel Parzy. 
 
Séance plénière du 23 novembre (matin) 
- présents :  
Jean-Christophe Pagès, Président, Claudine Franche, Vice-présidente, Pascal Boireau, Vice-président 
et par ordre alphabétique des noms de famille :  
Claude  Bagnis,  Marie-Anne  Barny,  Thierry  Brévault,  Denis  Couvet,  Hubert  de  Verneuil,  Philippe 
Guerche, Joël Guillemain, Guillermina Hernandez-Raquet, Bernard Klonjkowski, Marc Lavielle, Valérie 
Le Corre, Olivier Lemaire, Didier Lereclus, Rémi Maximilien, Eliane Meurs, Didier Nègre, Sergio Ochatt, 
Catherine  Regnault-Roger,  Patrick  Saindrenan,  Pascal  Simonet,  Marie-Bérengère  Troadec,  Bernard 
Vaissière, Jean-Luc Vilotte.  
- absents, représentés :  
Elie Dassa, Nadia Naffakh , Michel Renard.  
- absents, excusés :  
73 
 

 
Avner Bar Hen, Philippe Berny, Yves Bertheau (démissionnaire), Bruno Chauvel, Nathalie Eychenne, 
André Jestin, Jean-Louis Noyer, Daniel Parzy. 
Séance plénière du 23 novembre (après-midi) 
- présents :  
Jean-Christophe Pagès, Président, Claudine Franche, Vice-présidente  
et par ordre alphabétique des noms de famille :  
Claude  Bagnis,  Marie-Anne  Barny,  Thierry  Brévault,  Denis  Couvet,  Hubert  de  Verneuil,  Philippe 
Guerche, Joël Guillemain, Guillermina Hernandez-Raquet, Bernard Klonjkowski, Marc Lavielle, Valérie 
Le Corre, Olivier Lemaire, Didier Lereclus, Rémi Maximilien, Eliane Meurs, Didier Nègre, Sergio Ochatt, 
Catherine  Regnault-Roger,  Patrick  Saindrenan,  Pascal  Simonet,  Marie-Bérengère  Troadec,  Bernard 
Vaissière, Jean-Luc Vilotte.  
- absents, représentés :  
Pascal Boireau, Elie Dassa, Nadia Naffakh, Michel Renard.  
- absents, excusés :  
Avner Bar Hen, Philippe Berny, Yves Bertheau (démissionnaire), Bruno Chauvel, Nathalie Eychenne, 
André Jestin, Jean-Louis Noyer, Daniel Parzy. 
 
Séance plénière du 15 décembre (matin) 
- présents :  
Jean-Christophe Pagès, Président, Claudine Franche, Vice-présidente, Pascal Boireau, Vice-président 
et par ordre alphabétique des noms de famille : 
 Claude Bagnis, Marie-Anne Barny, Thierry Brévault, Bruno Chauvel, Denis Couvet, Elie Dassa, Hubert 
de Verneuil, Guillermina Hernandez-Raquet, Valérie Le Corre, Olivier Lemaire, Didier Lereclus, Didier 
Nègre,  Sergio  Ochatt,  Catherine  Regnault-Roger,  Michel  Renard,  Pascal  Simonet,  Marie-Bérengère 
Troadec, Bernard Vaissière, Jean-Luc Vilotte.  
- absents, représentés :  
Philippe  Guerche,  Joël  Guillemain,  Bernard  Klonjkowski,  Eliane  Meurs,  Nadia  Naffakh,  Jean-Louis 
Noyer, Patrick Saindrenan.  
- absents, excusés :  
Avner Bar Hen, Philippe Berny, Yves Bertheau (démissionnaire), Nathalie Eychenne, André Jestin, Marc 
Lavielle, Rémi Maximilien, Daniel Parzy. 
 
 
74 
 

 
Appendix V Indirect and non-specific risks 
 
Risks associated with traits already obtained by regulated or unregulated techniques 
If the modifications induced remain within the limits of variation for the species and its relatives, the 
risks will be the same as those resulting from conventional breeding.99 
Among the impacts on agricultural ecosystems already observed for plants obtained by both regulated 
and  unregulated  techniques,  some  were  foreseeable  and  have  already  been widely  recorded:  they 
include circumvention of resistance genes following evolution in the target pathogens (Burdon et al., 
2014; Jones et al., 2014). Similarly, a number of populations of target species for varieties expressing 
a Bt protein are showing resistance (Devos et al., 2013; Tabashnik et al., 2013). Unexpected effects 
have sometimes been found: a frequently cited example is that of maize varieties carrying the Texas 
sterility cytoplasm, which have been susceptible to corn leaf blight (Smith et al., 1971; Tatum, 1971). 
 
•  Direct risks100 to human health  
These concern, firstly, the potential toxicity of novel components that might be present in the plant 
and  its  by-products  and  their  impact  in  terms  of  nutritional  balance,  in  combination  with  dietary 
exposure,  and,  secondly,  possible  allergic  phenomena  following  airborne  exposure  (pollen),  skin 
exposure (among workers in particular) or food exposure. These risks are common to all new varieties. 
•  Direct risks to ecosystem health  
The  first  type  of  risk  concerns  dispersal  and  the  risk  of  invasion  of  natural  plant  communities  if  a 
variety’s new phenotypic characteristics are likely to increase its ability to persist in fields by forming 
volunteer  populations  and  to  disperse  outside  cultivated  areas  (feral  populations)  (Garnier  and 
Lecomte, 2006; Garnier et al., 2006, 2008), possibly invading natural environments (never recorded for 
a crop plant to date). This first type of risk may also occur through gene flow by pollen to wild forms 
of the same species or related wild species (Chèvre et al., 1997) if hybrids have increased persistence 
and/or invasion capability (here again not recorded to date).  
The  second  type  of  risk  concerns  impacts  on  biodiversity  through  modification  of  ecological  and 
particularly trophic interactions 
between the plant and pathogenic, parasitic or consumer organisms, 
as  well  as  mutualists  or  symbionts,  since  these  organisms  can  come  from  the  whole  range  of 
biodiversity (bacteria, fungi, plants, insects, other animals, etc.). In the case of traits directly aimed at 
making a variety pest-resistant or pest-tolerant or intended to improve interaction with symbionts, it 
is useful to distinguish effects on target organisms from effects on non-target organisms. Direct risks 
can cover toxic effects on non-target animal consumers, the effect on communities of limiting a target 
                                                           
99 Although insertion of a sequence encoding a single desired gene using an NPBT may be considered to entail 
less risk than traditional introgression, through hybridisation and backcrossing, of a region encoding this same 
gene. 
100 Within the meaning of Directive 2001/18/EC. 
 
75 
 

 
species  (species  replacement),  and  resistance  evolution  in  the  target  species  in  response  to 
evolutionary pressure from a variety.  
•  Indirect risks101 
These may arise from changes in farming practice (including those associated with new varieties, such 
as use of certain active ingredients (Bohan et al., 2005; Bonny, 2016; Lamichhane et al., 2016)) and 
modification  of  habitats  for  wanted  or  unwanted  species  owing  to  the  proliferation  of  “modified” 
varieties (ease of growth, evolutionary pressure).  
Specific case of herbicide tolerance: a collective scientific assessment on breeding of herbicide-tolerant 
plants is available from the French National Institute for Agronomic Research (INRA).102 This issue could 
be considered by any organisation, including HCB, in a dedicated working group.  
Management  of  these  risks  for  both  regulated  techniques  (GMOs)  and  unregulated  techniques 
(conventional  breeding,  random  mutagenesis)  necessitates  biomonitoring  systems  that  generally 
make it possible to identify and limit the onset of these types of risk or prevent them from developing. 
The  potential risks  arising  out  of  desired  traits  are different  for  each  individual  trait  and  are  not 
affected by the technique used to obtain it.  

 
Risks associated with human impact on the pace of change of crop organisms 
The  power  to  modify  crop  species  may  lead  to  a  faster,  human-controlled  pace  of  phenotypic 
evolution.  Site-directed  modifications  have  broken  with  the  rules  of  biological  evolution  based  on 
random mutation and recombination events and are followed by natural selection (Vigouroux et al., 
2011). Thus human beings could further increase their impact on the living organisms that they grow 
by comparison with the impact of domestication and selection of random variations. Human beings 
thus have a not inconsiderable effect on their environment. 
However,  ever  since  they  were  domesticated,  crop  plants  have  followed  an  evolutionary  pattern 
dependent on selection by farmers and breeders (Vigouroux et al., 2011). Thus, until recently, artificial 
selection of plants by man was not based on any special knowledge of the genes involved. This has 
changed over past years: random mutagenesis techniques made their appearance some twenty years 
ago, followed by molecular selection of the desired modification, usually a gene deletion (Mba, 2013; 
McCallum et al., 2000; Parry et al., 2009; Suprasanna et al., 2015; Tadele et al., 2010).  
The past twenty years have also seen the option of high-throughput laboratory screening for a wide 
combination of random modifications at multiple gene sites or in multiple genes at once, an approach 
often  called  “directed  evolution”  (even  though  it  uses  laboratory  selection  and  randomness).  An 
alternative approach is rational design (Castle, 2004; Dixon et al., 2003; Rao, 2008; Yuan et al., 2005). 
In  both  cases,  laboratory  improvement  of  a  protein  or  metabolic  pathway  is  followed  by  its 
introduction into the organism of interest by site-directed mutagenesis or transgenesis.  
                                                           
101 Within the meaning of Directive 2001/18/EC. 
102  https://www6.paris.inra.fr/depe/Projets/Varietes-Vegetales-Tolerantes-aux-Herbicides  (summary  available 
in English). 
76 
 

 
Red Queen effect on biodiversity 
Change in evolutionary parameters, such as the rate of phenotypic change, could lead to qualitative 
changes in interaction between species and have far-reaching implications for ecosystems, depending 
on the extent to which these plants are adopted.  
The  overall  effects  on  biodiversity  are  hard  to  predict,  since  they  depend  in  large  measure  on  the 
degree of environmental exposure (adoption, and changes in cropping patterns, as is already the case). 
However, mention may be made of: 
•  Greater selection pressure on target pests (pathogens, insects) with faster widespread 
deployment of resistance genes in crop varieties. The outcome of such an increase in 
selection  pressure  is  uncertain.  In  theory,  while  NPBTs  allow  simultaneous 
accumulation of multiple major and/or quantitative resistance genes in plant varieties, 
pests’  ability  to  evolve  in  response  to  this  new  selection  pressure  should  decline 
(Burdon  et  al.,  2014;  Jones  et  al.,  2014).  However,  inappropriate  deployment  of 
resistance  gene  combinations  could  have  the  opposite  effect.  Other  evolutionary 
responses may also occur, such as changes in host range, with pests becoming harmful 
for  new  species,  a  development  also  found  in  non-GM  crops  (Stukenbrock  and 
McDonald, 2008). 
•  Extension of farming to new environments with introduction of plant varieties tolerant 
to  extreme  conditions  such  as  drought  and  salinity  and  with  more  land  under 
cultivation  if  plant  traits  allow  new  uses  such  as  chemurgy  (biofuels,  polymers, 
therapeutic  molecules,  etc.).103  An  increase  in  farmland  is  the  primary  cause  of 
biodiversity decline (Newbold et al., 2015), since uncultivated ecosystems are being 
replaced  by  agricultural  ecosystems.  It  should,  however,  be  noted  that  positive 
impacts may also be expected (for example, more carbon storage in soil, leading to 
lower emissions of some greenhouse gases, or reduced use of fossil fuels). 
The HCB Scientific Committee notes that most breeding methods, whether NPBT or conventional, may 
show  bias  owing  to  the  sampling  used  for  reseeding  (Vigouroux  et  al., 2011),  which  would  require 
corrective action.  
The HCB Scientific Committee further notes that issues relating to deliberate modification of non-crop 
plants (such as ragweed to make it less allergenic) should be discussed in a different context.  
 
Risks associated with any persistence of delivery tools 
For use of SDNs, RdDM, negative segregants, cisgenesis and intragenesis, a number of methods for 
introducing reactants into a cell (delivery) are possible (see Section 2.3). Up to now, these methods 
have  concerned  only  “conventional”  GMOs.  Some  countries  such  as  the  United  States  authorise 
                                                           
103 
http://institut.inra.fr/en/Objectives/Informing-public-policy/Foresight/All-the-news/Agrimonde-Terra-
foresight-study 
 
77 
 

 
genetically modified plants on the basis of delivery method,104 for example regulating use of bacteria 
or viruses in a specific way. 
For Agrobacterium delivery and agro-infiltration there is a risk that the bacteria carrying modified T-
DNA may propagate in the environment with sequences of other bacteria or eukaryotic sequences. 
Such release is itself subject to regulation and must therefore be verified in contained use for SDNs, 
RdDM, negative segregants, cisgenesis and intragenesis. The bacteria can be eliminated by appropriate 
antibiotic treatment, but it must be ensured that they are actually absent before any uncontained use 
of these plants.105 This requires the type of delivery and the absence of bacteria release during the 
process and in the plants then marketed to be documented. 
For  delivery  through  an  autonomously  replicating  episome  (virus  sequences,  for  example),  this 
autonomous  replication  may  persist.  Most  of  the  virus  sequences  used  do  not  usually  enter  the 
gametes (see Section 2.6.1), but in the absence of sufficient information, this must be verified. 
In the case of biolistics, use of protoplasts and plant regeneration from a cell, a number of unwanted 
genetic and epigenetic modifications are inevitable (see off-target effects). 
 
Risks associated with modification selection methods 
For cisgenesis, intragenesis, transgenesis, SDN and RdDM techniques there are additional risks relating 
to persistence of selectable markers (often transgenes from other species; see Section 2.4). It must be 
ensured that these selectable markers have been removed and their removal has not caused damage. 
If the selectable markers remain, the plants are then de facto GMOs according to the regulations and 
must be assessed as such. 
 
Risks associated with short interfering RNA expression in the plant 
One  subcategory  of  cisgenesis  (cisgenesis  of  a  micro-RNA  gene,  for  example)  and  of  intragenesis 
consists in expression of a micro-RNA, an antisense RNA or a double-stranded RNA interfering with 
gene expression through various mechanisms (Auer and Frederick, 2009). In this case, short interfering 
RNA can cause off-target effects for modification of genetic expression (Molesini et al., 2012; Xu et al., 
2006). Since plants have amplification enzymes for short RNA, the latter can be amplified in the plant 
and propagate in different cells. 
The specificity of short RNA measuring around 20-25 base pairs is low (Xu et al., 2006), especially in 
the case of micro-RNA, which can suppress targets with mismatches of several base pairs (Molesini et 
al., 2012). This can affect expression of a number of genes and therefore could in theory affect the 
plant’s phenotype, such as its dispersal capacity or metabolite/toxin production, if the plant contains 
such  genes.  Plants  express  a  number  of  micro-RNAs  that  might  have  this  type  of  effect  through 
                                                           
104 https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/biotechnology/SA_Regulations 
105 However, the Scientific Committee notes that at present most of these plants are for contained use. 
78 
 

 
mutation. To date there have been no cases of toxin induction through mutation of a micro-RNA as far 
as the Scientific committee of the HCB is aware. 
 
Risks associated with release of short interfering RNA into the environment 
In the case of intragenesis consisting in expression of short interfering RNAs, double-stranded RNAs 
may  be  released  into  the  environment  and  affect  other  organisms,  since  some  of  the  latter 
(nematodes, arthropods, eukaryotes,  single-cell organisms, etc.) may import double-stranded  RNAs 
from  the  environment.106  Double-stranded  RNAs  could  thus  reach  and  affect  other  non-target 
organisms (Ramesh, 2013).  
These  off-target  effects  are,  however,  hard  to  predict,  and  it  would  be  impossible  to  test  all  the 
organisms that might be found in agricultural conditions. 
 
Risks associated with unintended systematic and multigenerational effects 
RdDM aims to produce a multigenerational effect that is not strictly genetic (DNA methylation), but 
effects on other loci can also occur unintentionally. As above, this can affect expression of a number 
of genes. 
In  the  case  of  grafts,  these  unintended  effects  may  occur  through  systemic  propagation  of  short 
interfering RNA in the plant. 
In the case of negative segregants, unintended multigenerational effects may occur, particularly with 
DNA  methylation.  This  type  of  effect  is  also  to  be  found  in  interspecific  hybridisation,  and  even  in 
conventional hybridisation within the same species.  
The Scientific Committee notes that a risk of the same nature theoretically exists with hybridisation in 
general, although it has not been recorded.  
 
Genome- and environment-dependent risks 
In the same way that a combination of two genetic modifications can result in unforeseen phenotypes, 
each modification interacts with the genetic background and the environment. Modification of trait 
expression under the influence of environmental conditions is taken into account when testing new 
varieties  in  different  environmental  conditions,  but  this  cannot  cover  the  whole  range  of  possible 
conditions. For the time being, use of models to complement or replace testing is not possible, since 
statistical models for “genotype x environment” interaction or including genomic covariates are more 
explanatory than predictive (Gauffreteau et al., 2016; Gauffreteau, A. et al., 2015; Heslot et al., 2014). 
                                                           
106 This phenomenon is used in particular to target a gene in a pathogen outside the plant, such as an insect 
(Younis et al., 2014). This targeting of another organism employs a foreign transgene (conventional GMO) and 
therefore does not come within the category of intragenesis. 
79 
 

 
Modification  as  a  result  of  the  genomic  context  would  be  relevant  if  a  genetic  modification  was 
authorised irrespective of its genetic background (the rest of the genome). Introduction of the same 
modification into a different genetic background in the same species can have different effects on the 
phenotype and its variability, and all the more so in another species (Chandler et al., 2013; Hall et al., 
2007; Roles et al., 2016). 
 
Risks  associated  with  off-target  genome  modifications  due  to  delivery  and 
regeneration 
•  Unintended  genome  modifications  due  to  use  of  protoplasts,  Agrobacterium  for  transfection, 
and/or regeneration  
In the case of biolistics, use of protoplasts and plant regeneration from a cell, unwanted genetic and 
epigenetic modifications (some inheritable) are frequent, including alterations in chromosome dosage 
(Bairu et al., 2011; van den Bulk et al., 1990; Jiang et al., 2011; Kaeppler et al., 1990; Machczyńska et 
al., 2015; Ong-Abdullah et al., 2015; Rhee et al., 2010; Stelpflug et al., 2014). Moreover, the whole 
plant is regenerated from undifferentiated cells through clonal propagation of varieties obtained by 
conventional breeding. How a genotype can result in a variety of phenotypic outcomes under the same 
culture conditions  is still not  properly understood  (Krishna et al., 2016), but since  some  causes  are 
known,  action  can  be  taken  to  reduce  their  impact  on  regenerated  plants  (Bairu  et  al., 2011).  This 
includes i) choice of a genotype free of variations or in vivo mutations and one that is associated with 
regeneration by embryogenesis rather than organogenesis (if available), ii) fewer passages between 
culturing of explants and regeneration, iii) use of the lowest possible growth-regulator concentrations 
to shorten the growth phase of undifferentiated tissues prior to regeneration as much as possible and 
promote better cell-cycle control, and iv) prevention of action of known effectors of oxidative stress 
responsible  for  breaks  in  DNA  and  risks  of  DNA  hyper-  and  hypomethylation.  Agrobacterium 
transformation  may  also  occasionally  produce  unintended  modifications,  for  example  through 
insertion  of  bacterial  chromosomal  DNA  (Ülker  et  al.,  2008)  or  breaks  in  T-DNA  (Schouten  and 
Jacobsen, 2007). 
A paper has shown that when plant protoplasts were transfected with a plasmid encoding both the 
nuclease and guide RNA, in 0.06% to 0.14% of cases, small insertions of DNA from the plasmid would 
occur at the cleavage site (Kim and Kim, 2016).  
In the case of agro-infiltration, unwanted integration of transgenes may cause off-target effects of the 
same nature.  
The Scientific Committee would nevertheless point out that generation of transgenic plants using these 
delivery methods has been taking place for twenty years, and it is not aware that any plants placed 
on the market have shown a problem associated with these methods.
 
•  Unintended genome modifications due to integration site  in the case of SDN-3, cisgenesis and 
intragenesis (together with conventional GMOs) 
In  the  case  of  cisgenesis  and  intragenesis,  insertion  of  the  transgene  into  the  genome  may  have 
uncontrolled effects, such as interruption of an endogenous gene at the locus, formation of new coding 
sequences  or  deregulation  of  gene  expression  at  the  integration  site  or  other  loci.  In  the  case  of 
80 
 

 
cisgenesis, although the transgene is usually expected to be transcribed intact, insertion may produce 
knock-out or combination with the endogenous locus where the insertion occurs, which may lead to 
abnormal transgene expression with unforeseen regulatory sequences and production of an abnormal 
fusion transcript or even an antisense transcript, which would then amount to intragenesis. 
As for SDN-3, advances in plant genomics will probably make it possible to identify “safe harbour loci”, 
i.e.  sites  that  are  in  non-coding  regions  and  possess  high,  stable  gene  expression,  which  could  be 
targeted for transgene insertion (Cantos et al., 2014). 
 
Risks associated with pleiotropy 
Gene modification (SDNs, ODM and RdDM) and transgene insertion (intragenesis and cisgenesis) can 
affect  traits  other  than  those  associated  with  the  organism’s  desired  phenotype  (pleiotropy). 
Pleiotropic effects (i.e. affecting plant traits other than the desired trait, although only the target gene 
has been modified) can result from targeted genetic modifications. These effects exist whatever the 
plant breeding method used (conventional breeding, random mutagenesis, etc.). It is difficult to test 
all these methods and anticipate them in field conditions. Some may be identified by the breeder in 
the course of the breeding process or when the crop is grown. Such modifications might not have been 
detected in the laboratory during phenotypic testing of varieties if they altered the level of certain 
components, for example, or susceptibility to particular pathogens. In some cases it is conceivable that 
gene  control  or  silencing  through  SDNs,  ODM  or  grafting  may  activate  synthesis  of  more  or  less 
undesirable or even toxic products that were not synthesised in the crop variety originally. However, 
there are no known examples.  
 
Risks associated with new ecological interactions 
These  new  ecological  interactions  cover  plants,  animals  and  microorganisms.  They  may  lead  to  a 
decline  in,  and  even  extinction  of,  some  species,  and  conversely  a  proliferation  of  others,  and 
consequently  to  changes  in  the  composition  of  the  communities  to  which  these  species  belong. 
However,  these  species  and  communities  have  already  been  exposed  to  the  effects  of  natural 
mutations  and  have  had  the  opportunity  to  adapt.  Natural  mutations  give  rise  to  ecological 
interactions that are part of the evolution of ecosystems. 
The new risks that may result concern health and the environment. Various types of new ecological 
interactions must be considered: 
o  Interactions with different human microbiota, particularly in the gut, in relation to 
proper functioning of the immune system (O’Doherty et al., 2014), and the various 
dysbioses that may arise. 
o  Interactions  with  the  different  microbiota  of  plants  and  the  microbiota  of  the 
animals that eat these plants. 
o  Interactions with soil microorganisms. The latter play a major part in the functioning 
of ecosystems – soil fertility, carbon storage and water and air purification – as well 
as in the health of living organisms, particularly human beings. 
o  Interactions  with  other  species,  particularly  those  playing  a  key  role  in  the 
functioning of ecosystems, such as pollinators. 
81 
 

 
These  “new  ecological  interactions”  can  have  a  direct  impact  on  human  beings  without  the 
intermediary of other species. New proteins produced may, for example, result in allergenicity (Traidl-
Hoffmann et al., 2009) or a reduction or increase in components beneficial to human health (vitamins, 
antioxidants, polyunsaturated fatty acids, etc.). 
The  Novel Traits obtained necessitate  a risk  assessment for human beings and/or ecosystems on a 
case-by-case  basis,  with  assessment  systems  that  include  the  impact  on  human  and  non-human 
microbiota.  
 
 
82 
 

 
Appendix VI Glossary 
 
For reasons of consistency the HCB Scientific Committee has chosen to give certain terms that might 
be used in other contexts a specific meaning that is explained in this glossary. To avoid any confusion, 
the Scientific Committee would like to clarify that this glossary applies only to this opinion. 
 
Effectors: Molecules (proteins or nucleic acids (RNA or DNA)) used to obtain the desired modification 
in the plant.  
Vectors:  In  this  definition  a  vector  is  the tool  for transferring  a  gene.  Vectors are  needed  because 
genetic information is not easily transferable into a cell. 
A vector consists of two types of molecule: 
•  The molecule to be transferred: this carries the genetic information, whether as RNA or DNA. 
The same vector can transfer a number of molecules, including different types of molecule. 
•  The complex of molecules that makes the transfer possible. For plants, this complex is usually 
viral  or  bacterial.  It  contains  microorganisms  that  have  been  modified  to  transfer  genetic 
information. The modification of the parent organism that becomes the vector is intended to 
eliminate the pathogenicity of the original microorganism. The vector is easy to handle in vitro 
and will be the vehicle for transfer. 
During or after transfer the second vector component is usually removed from the cell in which the 
genetic information has been inserted. 
Some vectors are called "inert" because they consist of synthetic molecules whose physicochemical 
capacities allow the genetic material to be inserted into the cell. Methods of transfer also exist that 
are mainly physical (electroporation, ultrasound, etc.). 
Choice of vector depends on the cell into which the genetic information is to be transferred, taking 
account of its efficiency and persistency. 
Proteins can also be delivered in vector form, usually by physical methods. Use of a vector, whatever 
its nature, results in a transient modification in the target cell.  
Novel trait: A new characteristic arising out of the insertion of one or more genes or from modification 
of the expression of one or more genes in the organism in question. The Scientific Committee draws a 
distinction between two types of novelty:  

Introduction into a variety of a trait identified in another variety or another related or sexually 
compatible species: the idea is to enhance existing genetic diversity by introducing allelic states 
of interest. Consequently, there is no addition107 of genetic sequences or any modification of 
the function of the genes already present in the plant. 
                                                           
107  It  is  important  to  clarify  the  concept  of  addition  for  cisgenesis  and  intragenesis.  Genetic  material  may  be 
introduced, but the genes inserted already exist in the species in a different allelic state or are present in certain 
varieties of the same species. 
 
83 
 

 

Introduction of an entirely new trait into a variety and/or related species:108 the novel trait 
stems from the fact that the gene is not naturally present in the species in question or the 
modification of an existing gene introduces a new metabolic pathway or new function into the 
species. 
Biomonitoring introduced by the 1999 Outline Farming Act: The purpose of the latter was to identify 
and monitor any emergence of unintended effects of new GM varieties on:  
•  Pest populations, 
•  Wild flora and fauna, 
•  Aquatic environments, 
•  Microbial populations (including viruses). 
 
In fact, some unintended effects might emerge only after large-scale cultivation and over a number of 
years (e.g. onset of resistance in target insects, emergence of resistant weeds). But these are issues 
affecting  any  varietal  innovation  and  are  not  specific  to  products  obtained  by  NPBTs.  Post-market 
monitoring procedures were set out by EFSA in 2006 and updated in 2011 (EFSA, 2011). They were 
tested for assessment during the EU AMIGA project.109 The results of this project will support thinking 
on how to establish large-scale monitoring. This could also be organised around existing monitoring 
and surveillance networks (EFSA, 2014; Reboud et al., 2013). Moreover, there already exists a national 
biological  monitoring  network  for  plants,  responsible  for  monitoring  unintended  effects  of  plant 
protection practices (coordinated by the Plant Protection and Quality Subdirectorate of the Directorate 
General  for  Food,  cf.  Theme  3  of  the  Ecophyto  II  plan  published  in  October  2015),  and  a  national 
network for epidemiological crop surveillance. 
 
Directive 2001/18/EC: Directive 2001/18/EC regulates cultivation and placing on the market of GM 
plants  (if  not  excluded  under  Annex  I B).  It  covers  the  transgene  insertion  event  and  allows 
authorisation  of  import  or  cultivation  of  plants  containing  such  events  whatever  their  genetic 
background. 
An  application  for  authorisation  (import  for  food  or  feed  uses  or  for  cultivation)  of  a  genetically 
modified plant must include a full description (laid down in Annex III B of Directive 2001/18/EC) of the 
plant and its transformation together with information about its cultivation (taxonomic identification, 
reproduction,  compatibility  with  other  cultivated  or  wild  plant  species,  distribution  in  Europe  of 
compatible  species,  survivability,  dissemination  associated  with  pollen  quality  and  viability, 
                                                           
108 This distinction is highlighted in Canada’s GMO rules, which provide for assessment only in the case of varieties 
having a new trait not previously present in the variety or related species (http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/gmf-
agm/index-eng.php)

 
109 AMIGA, Assessing and Monitoring the Impacts of Genetically Modified Plants on Agro-ecosystems (FP7, 2011 
- 2016): http://www.amigaproject.eu/ 
84 
 

 
mechanisms of interaction with target and non-target organisms, site management after cultivation, 
etc.).  
An  assessment  of  risks  to  health  (allergenicity,  toxicity  and  nutrient  composition)  and  to  the 
environment (direct and indirect risks, immediate or delayed effects, as well as cumulative long-term 
effects) must be carried out. Environmental risks are assessed by comparing the genetically modified 
plant (GMP) with an untransformed organism. Annex II of the Directive specifies the adverse effects 
that must be considered. Applications have to contain information on: (i) likelihood of persistence and 
invasiveness, including gene flow between plants; (ii) potential plant-to-microorganism gene transfer; 
(iii)  interactions  between  the  GMP  and  target  organisms,  and  their  consequences;  (iv)  interactions 
between  the  GMP  and  non-target  organisms;  (v)  effects  on  biogeochemical  processes.  Routes  of 
exposure must also be considered. Last but not least, a risk management strategy must be proposed. 
The application must outline post-market monitoring built around the environmental monitoring plan 
with  scenarios  for  various  critical  situations.  This  monitoring  will  have  two  strands:  case-specific 
monitoring for foreseeable effects (e.g. onset of resistance in target insects) and general surveillance, 
i.e. with no prior assumptions (Regnault-Roger, 2014).  
Mesocosm:  A  mesocosm  is  a  controlled  or  semi-controlled  contained  environment  where  an 
investigator can vary some or all of its parameters over a significant period of time and thus reveal a 
large  number  of  ecological  effects  on  interacting  species,  particularly  microorganisms,  that  would 
otherwise  have  gone  unnoticed.  The  trial  must  last  long  enough  for  ecological  interactions  and 
feedback to develop. Use of mesocosms should be considered whenever relevant to assessment prior 
to field release,. This type of study, preceding field trials, could help uncover changes in the functioning 
of microbial and animal soil communities and analyse their causes (De Vries et al., 2015; Wolfarth et 
al., 2016) as well as analyse the effects of global change at small spatial scales (Stewart et al., 2013). 
Mesocosm  studies  would  make  it  possible,  for  example,  to  assess  the  impact  of  a  novel  trait  on 
microbiota diversity in the light of current knowledge concerning microbial ecology. 
  
 
85