Esta es la versión HTML de un fichero adjunto a una solicitud de acceso a la información 'New GM techniques (also called new breeding techniques)'.




   
Ref. Ares(2016)1831941 - 18/04/2016
Ref. Ares(2016)2053620 - 29/04/2016
   
   
Genetic   Engineering   in   Plants   and   the   
   
   
   
New   Breeding   Techniques   (NBTs)   
xxxx@xxxxxxxx.xxxx 
www.econexus.info 
   
   
Inherent   risks   and   the   need   to   regulate   
Briefing 
December 2015 
Dr.   Ricarda   A.   Steinbrecher   
   
   
Summary   and   conclusions   
Over   the   last   5-­‐10   years   there   have   been   rapid   developments   in   genetic   engineering   
techniques   (genetic   modification).   Along   with   these   has   come   the   increasing   ability   to   make   
deeper   and   more   complex   changes   in   the   genetic   makeup   and   metabolic   pathways   of   living   
organisms.   This   has   led   to   the   emergence   of   two   new   fields   of   genetic   engineering   that   
overlap   with   each   other:   synthetic   biology   and   the   so-­‐called   New   Breeding   Techniques   
(NBTs).   
As   regards   NBTs,   it   is   of   concern   that   many   efforts   seem   designed   primarily   to   avoid   having   
to   go   through   the   regulatory   process   for   GMOs,   whilst   choosing   names   that   make   it   difficult   
for   the   public   to   see   that   genetic   engineering   (genetic   modification)   is   being   used.   This   goes   
alongside   efforts   to   weaken   the   precautionary   principle,   which   is   there   to   guard   against   
adopting   technologies   that   are   considered   likely   to   bring   negative   impacts   on   human   and/or   
environmental   health   in   the   future.   
Currently   there   is   a   list   of   7   “new”   genetic   engineering   techniques   before   the   European   
Commission,   which   is   deciding   whether   or   not   the   products   of   these   techniques,   when   
applied   to   plants,   are   covered   by   the   EU   GMO   laws.   Claims   are   being   made   by   the   industry   
either   that   they   are   not   GMOs   according   to   the   current   legal   definition   of   a   GMO,   are   made   by   
techniques   exempted   from   coverage,   or   that   the   final   product,   even   if   genetic   engineering   was   
used   at   some   point   during   its   development,   does   not   contain   GM   material   and   so   is   no   longer   
a   GMO.   The   EC   is   currently   working   on   the   legal   interpretation,   as   are   many   lawyers   from   
industry   and   civil   society.   It   is   important   to   be   aware   -­‐   both   in   terms   of   legal   interpretation   
and   of   risks   -­‐   that   some   of   theses   techniques   may   also   be   used   in   combination   with   each   other   
or   the   same   technique   may   be   used   several   times   over   in   order   to   achieve   the   intended   effect.   
This   briefing   looks   at   these   7   techniques   from   the   scientific   rather   than   the   legal   perspective   
and   aims   to   help   readers   to   better   understand   the   techniques   and   the   inherent   risks   
associated   with   them.   Whilst   examining   the   likely   unintended   effects   it   has   become   evident   
that   all   of   the   techniques   claiming   great   precision   are   also   found   to   have   off-­‐target   effects   
with   unpredictable   consequences.      In   fact,   so   called   precision   is   actually   a   very   imprecise   
notion   and   does   not   equate   to   predictability.   
In   conclusion,   the   seven   new   genetic   engineering   techniques   referred   to   as   NBTs   each   
bring   their   own   set   of   risks   and   uncertainties.   Whilst   many   of   these   are   the   same   as   

with   older   GM   techniques   there   are   also   serious   additional   concerns,   such   as   the   
potential   environmental   and   health   impacts   of   RNA   dependent   DNA   methylation   

(RdDM).   Equally   a   new   degree   of   uncertainty   and   risk   of   unintended   effects   arise   from   
the   use   of   gene   editing   techniques   (ZFN   and   ODM   as   well   as   CRISPR   and   TALENs).   This   
briefing   concludes   that   there   is   a   scientific   case   for   classifying   all   these   techniques   as   

GM   and   regulating   their   use   with   as   much   rigour   as   previous   and   current   GM   
techniques.   

      
   
   
1   

The   7   techniques   under   scrutiny   are   (following   the   EC’s   own   titles)1:   
1)   Zinc   Finger   Nuclease   Technology      (ZFN-­‐1/2/3)         
   
   
2)   Oligonucleotide   Directed   Mutagenesis   (ODM)       
   
   
3)   Cisgenesis/Intragenesis      
4)   RNA-­‐dependent   DNA   methylation   (RdDM);   
5)   Grafting      (onto   a   GMO   rootstock);      
6)   Reverse   Breeding   (RB);   
7)   Agro-­‐infiltration   (both   Agro-­‐infiltration   ‘sensu   stricto’   &    Agro-­‐inoculation)   
An   8th   technique   was   considered   by   the   EC   working   group:   Synthetic   genomics.   However   it   
is   generally   regarded   as   a   field   within   synthetic   biology.   Furthermore,   no   link   to   current   
plant   breeding   programs   has   been   reported,   though   its   application   is   being   researched   for   
example   in   microorganisms.   
   
1)   Zinc   Finger   Nucleases      (ZFN)    types   -­1,   -­2   and   -­3      (Gene–editing   techniques)   
ZFN   techniques   are   genetic   engineering   techniques   that   aim   for   deliberate   changes   to   the   
genetic   make   up   and   traits   of   an   organism.   They   are   also   known   as   gene-­‐editing   techniques.   
Other   gene   editing   techniques   are   now   becoming   prominent,   but   ZFN   is   the   only   one   
mentioned   on   the   EU   list.   
The   aim   is   to   be   able   to   change   the   sequence   of   the   DNA,   in   order   to   delete,   substitute   or   
insert   DNA   sequences   at   pre-­‐determined   locations   in   the   genome.   In   this   way,   the   
objectives   are   no   different   to   any   other   engineering   technique.   In   the   case   of   the   ‘editing’   
techniques,   this   can   mean   small   changes   to   1-­‐10   nucleotides2   (ZFN-­‐1   and   2),   or   large   
insertions   of   whole   genes,   including   transgenes   (ZFN-­‐3).   
For   this   purpose   the   DNA   molecule   first   needs   to   be   ‘cut’   at   a   specific   location.   ZFNs   are   
proteins   that   are   custom-­‐designed   and   utilised   for   this   purpose.   The   “zinc   finger”   (ZF)   
component   can   recognise   a   specific   short   stretch   of   DNA   (9-­‐12   bases)   and   the   nuclease   (N)3   
component   will   cut   the   DNA   at   that   site.   It   requires   two   ZFNs   –   each   to   dock   diagonally   
across   the   double   stranded   DNA   –   to   cut   through   both   strands.   This   DNA   cut   will   then   
trigger   one   of   the   cell’s   two   DNA   repair   mechanisms   to   stick   the   loose   ends   together   again,   
with   a   number   of   possible   outcomes.   
3   categories   of   ZFNs:   
•  ZFN-­‐1:   small   site-­‐directed   random   DNA   changes,   which   may   be   small   deletions,   
substitutions   or   insertions   of   nucleotides.   In   this   case   the   cell   will   ‘repair’   the   break   in   a   
random   fashion,   using   a   repair   mechanism   called   ‘NHEJ’      (non-­‐homologous   end   joining).   
•  ZFN-­‐2:   small   site-­‐directed   intended   DNA   changes,   such   as   ‘point   mutations’   (one   
nucleotide   change).   Here   the   repair   will   follow   the   instructions   provided   by   a   DNA   
‘template’   that   has   been   added    (a   stretch   of   DNA   that   has   the   same   sequence   as   the   
target   area   but   with   one   or   two   small   alterations   or   a   short   insertion).   Here   the   repair   
mechanism   used   is   called   ‘HR’   (homologous   recombination).   
•  ZFN-­‐3:   large   site-­‐directed   insertions   of   genes   or   regulatory   sequences.   In   the   genetic   
engineering   process   a   DNA   template   will   be   added   as   in   ZFN-­‐2,   but   the   template   will   
also   contain   an   additional   long   DNA   sequence   (eg   one   or   more   genes)   for   integration.   
                                                                                                                                                                        
1   http://ec.europa.eu/food/plant/gmo/legislation/plant_breeding/index_en.htm   
2   Nucleotides   are   the   building   blocks   of   DNA   and   RNA,   which   is   the   genetic   material   also   referred   to   as   nucleic   
acids
.   The   nucleotides   are   made   up   in   DNA   of   A,   C,   G   and   T   (Adenine,   Cytosine,   Guanine,   Thymine);   and   in   
RNA   of   A,   C,   G   and   U   (Adenine,   Cytosine,   Guanine,   Uracil).   It   is   the   sequence   of   these   letters   that   will   
determine   which   protein   is   being   produced   or   which   instruction   is   given.   
3   Nuclease:   enzyme   capable   of   cutting   DNA.   
Inherent   risks   and   the   need   to   regulate:   ‘New   Breeding   Techniques   (NBTs)   
2   

The   gene   for   the   specifically   designed   ZFNs   will   commonly   be   introduced   into   the   plant   
through   genetic   engineering   with   standard   GM   transformation,   making   it   a   GMO   at   this   
stage.   Once   the   ZFN   proteins   have   been   expressed   and   done   their   work,   plant   lines   will   be   
selected   that   do   not   carry   the   transgene   for   the   ZFN   proteins.   Alternatively,   in   a   declared   
effort   to   avoid   being   designated   a   GMO,   plant   virus   expression   systems   have   been   
developed   where   the   ZFN   gene   is   meant   to   stay   within   the   viral   expression   system.   The   
intention   is   that   the   ZFN   transgene   will   not   integrate   into   the   plant’s   own   DNA   –   and   thus   
would   not   be   passed   on   to   future   generations.   
Commercial   Applications   ZFN-­‐1,   2:   The   loss,   change   or   insertion   of   a   single   nucleotide   
(point   mutation)   can   be   sufficient   to   change   traits   in   a   plant,   such   as:   herbicide   tolerance,   
male   or   female   sterility,   flower   colour,   delayed   fruit   ripening.      
Unintended   changes   and   risks:   
•  Off-­‐target   effects:   ZFN   technology   is   known   for   its   non-­‐specific   binding   to   non-­‐target   
DNA   and   thus   result   in   a   significant   level   of   off-­‐target   mutations   in   the   genome.   These   
mutations   can   a)   if   in   the   coding   sequence,   result   in   changes   of   function   of   proteins,   or   
b)   if   in   regulatory   sequences,   result   in   changes   in   the   expression   of   genes,   such   as   
increased   presence   of   plant   toxins,   or   absence   of   proteins   important   for   nutrition,   plant   
defence   or   disease   resistance.      
•  Template   DNA   (ZFN-­‐2   and   3)   may   integrate   randomly   into   the   genome,   as   do   transgenic   
insertions,   either   as   a   whole   or   in   parts,   disrupting   genes   and   regulatory   sequences   or   
potentially   resulting   in   altered   proteins.   This   may   lead   to   a   decrease   in   performance,   
heightened   disease   susceptibility,   accumulation   of   toxins   and   residues,   increase   in   
allergens.   
•  Transformation   and   transfection4   processes,   including   tissue   culture5,   are   used   in   the   
production   of   ZFN   genetically   modified   plants.   Such   processes   are   known   to   lead   to   
additional   mutations   (with   risks   as   detailed   in   the   bullet   points   above).6   
Conclusion:   All   three   ZFN   techniques   are   genetic   engineering   techniques,   aiming   for   
deliberate   changes   to   the   genetic   make   up   and   traits   of   an   organism.   They   are   laboratory   
techniques.   All   three   are   prone   to   off-­‐target   effects   due   to   the   ZFN   activity,   as   well   as   the   
effects   of   the   genetic   engineering   processes,   resulting   in   hundreds   of   mutations   and   
unintended   effects.   Further,   the   plant’s   own   repair   mechanisms   are   not   fully   understood,   
giving   rise   to   additional   uncertainties.   Due   to   the   process,   modifications   and   risks,   ZFNs   are   
GMOs   and   require   full   risk   assessments.   
Other   gene-­editing   techniques:   
There   are   several   other   gene-­‐editing   techniques,   called   TALENs,   meganucleases   and   
CRISPR/Cas.7   
Though   different   in   detail,   they   all   consist   of   nucleases   directed   to   specific   DNA   sequences   
where   they   will   cut   the   DNA   strand   and   evoke/trigger   a   natural   repair   system   of   the   cell,   as   
detailed   above.   
                                                                                                                                                                        
4   Transformation   of   plant   cells   is   the   process   of   getting   the   external   DNA   into   the   cell   and   incorporated   into   
the   plants   DNA.   The   term   transfection   of   plants   is   more   common   when   viruses   are   being   used   or   when   the   
external   DNA   is   not   meant   to   integrate.   
5   Tissue   culture   is   the   growing   of   plant   cells   in   growth   medium   away   from   the   plant.   Through   the   use   of   
nutrients,   special   compounds,   enzymes   and   various   growth   hormones,   cells   can   1)   reach   the   right   stage   for   
the   transformation   (insertion   of   the   new   gene   sequence)   and   2)   then   made   to   re-­‐grow   into   a   full   plant.   Tissue   
culture   –   especially   the   type   used   for   plant   transformation   –   is   known   to   cause   genome-­‐wide   mutations.   
6   See   also   Wilson   et   al.   (2006),   referenced   in   Background   Information   at   the   end.   
7   TALENs   (transcription   activator-­‐like   effector   nucleases),   MN   (meganucleases)   and   CRISPR/Cas   (clustered   
regularly   interspaced   short   palindromic   repeat   system)   –   see   also   Agapito-­‐Tenfen   (2015)   referenced   in   
Background   Information   at   the   end.   
EcoNexus   December   2015   
   
   
   
3   

The   same   considerations   that   lead   to   ZFN   techniques   being   classified   as   producing   GMOs   
also   apply   to   these   gene-­‐editing   techniques.   That   is,   they   aim   for   deliberate   changes   to   the   
genetic   make   up   and   traits   of   an   organism;   they   are   laboratory   techniques   and   are   prone   to   
off-­‐target   effects,   as   well   as   unintended   effects   from   the   genetic   engineering   processes.   
   
2)   Oligonucleotide   Directed   Mutagenesis   (ODM);   
The   aim   is   to   create   small   and   predesigned   changes   within   very   specific   sites   in   genes,   to   
either   change   the   function   of   the   gene   product   or   to   stop   its   production.      For   the   purposes   
of   ODM,   an   oligonucleotide8   that   is   a   short   stretch   of   a   single-­‐stranded   nucleic   acids   
composed   of   a   small   number   of   nucleotides   is   synthetically   produced.      
It   is   designed   to   be   almost   identical   to   the   DNA   sequence   of   the   target   gene,   except   for   1-­‐4   
nucleotides.   This   will   create   a   sequence   mismatch   when   the   oligonucleotide   binds   to   the   
target   gene,   inducing   a   site-­‐specific   DNA   change   (mutation)   once   the   cell’s   own   DNA   repair   
mechanism   is   triggered,   preserving   the   sequence   of   the   oligonucleotide   rather   than   the   
original   sequence.   
   
Unintended   changes   and   risks:   
•  Off-­‐target   effects:   The   oligonucleotide   can   bind   to   other   DNA   sites   to   which   it   is   
sufficiently   similar,   where   it   is   likely   to   cause   unintended   mutations.   These   in   turn   can   
result   in   changes   or   loss   of   function   of   proteins,   or   changes   in   the   expression   of   genes,   
leading   to   problems   such   as   increased   presence   of   plant   toxins.      
•  The   oligonucleotide   can   also   integrate   into   the   plant   DNA,   in   a   manner   similar   to   
transgenic   insertions,   disrupting   genes   and   regulatory   sequences   or   potentially   
resulting   in   altered   proteins.   
•  The   utilisation   of   tissue   culture   and   GM   type   transformation   or   transfection9   methods   
are   known   to   lead   to   genome-­‐wide   unintended   mutations.   
•  Near   target   site   mutations   have   been   observed   in   ODM   derived   GM   organisms.   
•  Depending   on   the   oligonucleotides   used,   there   is   a   risk   that   the   oligonucleotides   may   
interfere   with   a   cell’s   regulation   of   gene   expression,   by   triggering   the   RNAi   pathway10,   
which   can   lead   to   gene   silencing.   This   can   manifest   in   heritable   changes,   that   may   last   
for   many   generations,   and   which   depend   on   various   factors   that   are   not   well   
understood.   This   may   be   more   the   case   for   oligonucleotides   that   contain   RNA   
nucleotides.   
Conclusion:   ODM   is   a   genetic   engineering   technique   that   can   give   rise   to   the   same   or   to   
similar   direct   and   indirect   negative   impacts   as   current   GMOs,   both   due   to   the   intended   
traits   (eg   herbicide   tolerance,   as   performed   by   CIBUS   for   sulfonylurea   herbicides   in   oilseed   
rape)11,   the   processes   and   methods   used   and   the   potential   integration   of   the   
oligonucleotides.   It   thus   requires   full   risk   assessment.
                                                                                                                                                                        
8   Nucleotides   are   the   building   blocks   of   DNA   and   RNA,   the   genetic   material   also   referred   to   as   nucleic   acids.   
The   nucleotides   are   made   up   in   DNA   of   A,   C,   G   and   T   (Adenine,   Cytosine,   Guanine,   Thymine);   and   in   RNA   of   A,   
C,   G   and   U   (Adenine,   Cytosine,   Guanine,   Uracil).   
   Oligonucleotides   are   a   stretch   of   genetic   material   (nucleic   acid)   and   are   commonly   20-­‐200   nucleotides   long;   
they   may   consist   of   DNA,   RNA   or   nucleotide   analogues,   or   any   combination   of   those.   They   are   commonly   
single   stranded,   but   not   always.   
9   see   footnote   5   &   6   
10   RNAi   pathway.      The   RNA   interference   (RNAi)   pathway   is   an   internal   cell   process   in   which   RNA   molecules   of   
various   forms   can,   through   a   number   of   steps,   lead   to   the   silencing   of   genes.   
11   CIBUS   is   using   ODM   under   the   name   of   Rapid   Trait   Development   System   (RTDS™)   
Inherent   risks   and   the   need   to   regulate:   ‘New   Breeding   Techniques   (NBTs)   
4   

3)   Cisgenesis   and   Intragenesis      
Cisgenesis   and   Intragenesis   are   basically   the   same   as   transgenesis,   but   instead   of   sourcing   
the   DNA   sequence   from   totally   different   species   or   inventing   a   new   synthetic   DNA   
sequence,   the   sequence   of   the   DNA   inserted   will   be   sourced   from   the   same   or   closely   
related   species,   those   with   which   the   plant   would,   in   theory   at   least,   be   able   to   interbreed.   
In   ‘Cisgenesis’   the   DNA   inserted   will   have   been   made   according   to   the   exact   sequence   of   a   
gene   found   in   a   related   donor   organism.12   In   ‘Intragenesis’   the   inserted   gene   sequence   is   a   
composite,   made   up   of   sequences   and   elements   from   different   genes   of   one   or   more   closely   
related   species;   (see   footnote   for   details)13   
Unintended   changes   and   risks:   
•  Whether   or   not   the   DNA   sequences   come   from   closely   related   species   is   irrelevant,   the   
process   of   genetic   engineering   is   the   same,   involving   the   same   risks   and   
unpredictabilities,   as   with   transgenesis.   There   will   be:      
o  random   integration   of   the   transferred   DNA,   capable   of   disrupting   another   gene   or   
interfering   with   the   regulation   of   neighbouring   genes   (positional   effects).   
o  insertion-­‐site   mutations   and   genome-­‐wide   mutations   resulting   from   the   
transformation   processes,   including   the   effects   of   tissue   culture14.   These   can   include   
deletions,   rearrangements   and   multiplications   of   DNA   sequences.   
o  potential   for   gene   silencing   of   the   introduced   gene   or   the   plant’s   own   genes   if   
promoter   sequences   share   high   similarity   (homology).   
•  re   cisgenesis:   The   fact   that   the   inserted   gene   comes   from   a   related   species   is   no   
guarantee   that   there   are   no   unintended   or   unpredictable   effects,   as   neither   this   
particular   gene   nor   its   product   would   have   been   present   before   in   this   genetic   context   
or   position.   Hence   it   may   express   in   a   different   way   from   the   way   it   did   in   the   plant   
from   which   it   is   taken   and/or   interact   (eg   interfere)   with   wider   gene   regulation   or   
metabolic   pathways.   This   can   give   rise   to   altered   behaviour   and   performance,   higher   
susceptibility   to   disease,   increased   fitness   and/or   invasiveness,   altered   composition   of   
signalling   molecules15,   nutrients,   toxins   and   allergens.      
•  re   intragenesis:   the   DNA   sequences   assembled   in   such   a   gene   will   never   have   existed   in   
this   composition   and   in   this   regulatory   context   before.   Their   behaviour   and   
interactions   cannot   be   predicted   simply   by   knowing   the   DNA   sequence   or   by   knowing   
that   these   sequences   are   derived   from   related   organisms.   Only   a   full   analysis   and   strict   
assessment   of   the   actual   effects   and   impacts   can   provide   answers.   
Conclusions:   with   regard   to   risks   and   potential   negative   impacts,   there   is   little   to   
distinguish   these   techniques   from   transgenesis,   therefore   full   molecular   
characterisation   and   full   risk   assessments,   including   comprehensive   feeding   trials   for   
food   and   feed,   are   necessary.   
   
4)   RNA-­dependent   DNA   methylation   (RdDM);      
One   aim   is   to   obtain   a   new   trait   for   a   number   of   generations   of   seed,   and   to   do   so   without   
changing   any   DNA   sequences,   ie   the   sequence   of   nucleotides,   within   the   organism,   in   the   
hope   of   avoiding   it   being   classified   as   GM.   Instead,   a   process   of   RdDM16   can   be   utilised   
                                                                                                                                                                        
12   The   DNA   inserted   will   not   be   taken   directly   from   the   donor   organisms   but   rather   be   synthesised   in   vitro   or   
amplified   within   the   microorganism   E.   coli.   
13   e.g.   the   promoter,   coding   and   terminal   sequences   may   be   derived   from   different   genes   and   species.   
14   Tissue   culture:   see   footnote   5      
15   Signalling   molecules   will   transmit   information   between   the   cells   and   tissues   of   multicellular   organisms.   
They   can   be   simple   molecules   or   complex   proteins,   such   as   growth   hormones.   Another   category   are   the   so-­‐
called   semio-­chemicals,   that   carry   messages   between   different   individuals   either   of   the   same   species   or   
between   different   species.   
16   RdDM   is   a   form   of   RNA   interference   (RNAi).   
EcoNexus   December   2015   
   
   
   
5   

within   the   cell   to   silence   a   specific   gene,   so   there   will   be   no   gene   product   from   that   gene.   
This   in   turn   can   give   rise   to   desired   traits   such   as   delayed   fruit   ripening,   different   coloured   
flowers,   enhanced   content   of   specific   nutrients,   male   sterility.   
RNA-­‐directed   DNA   methylation   (RdDM)   is   a   process   where   RNA   molecules   direct   the   cell   to   
add   methyl   groups   (-­‐CH3   groups)17   to   certain   nucleotides   along   a   specific   stretch   of   DNA   in   
order   to   silence   a   gene.   (for   details   see   footnote)18   
The   methylation   of   the   promoter   region   of   a   gene   will   stop   the   expression   of   that   gene.   
Whilst   such   gene   silencing   is   not   a   permanent   alteration,   it   will   be   inherited   for   many   
generations.   In   plants   it   is   thought   to   eventually   fade,   but   this   is   not   true   for   all   organisms,   
e.g.   in   the   nematode   C.   elegans.   However   the   triggers   for   this   reversal   of   the   methylation   
are   not   known   or   understood.   
How   it   works:      
Any   small   double-­‐stranded   RNA   with   a   sequence   that   matches   the   sequence   of   a   stretch   of   
DNA   will   initiate   the   methylation   of   these   DNA   sequences,   and   thus   silence   the   associated   
gene.   There   are   a   number   of   ways   to   get   specific   sequences   of   double-­‐stranded   RNA   into   a   
cell,   for   example:   
(a)   genetically   engineering   the   plant   with   a   gene   that   will   produce   such   an   RNA   (with   an   
‘inverted’/reversed   sequence)   -­‐   intended   for   permanent   or   transient   gene   silencing.   
(b)   to   have   transient   gene   silencing,   ie   for   a   few   generations   only,   the   inserted   gene   can   be   
removed   (de-­‐selected)   by   back-­‐crossing   in   the   breeding   process.      
(c)   infection   of   plants   with   genetically   engineered   plant   viruses   (containing   the   targeted   
promoter   sequence),   which   will   result   in   the   silencing   of   the   targeted   gene   through   
methylation.   (‘Virus   Induced   Gene   Silencing’   (VIGS)   –   RdDM)   
(d)   spraying   of   plant   with   dsRNA   (double   stranded   RNA).       
Unintended   changes   and   risks:   
•  off   target   effects:   silencing   of   other   genes,   leading   to   altered   traits,   with   potential   
negative   impacts   such   as   the   production   and   accumulation   of   toxins   and   allergens,   
lowered   nutrient   content,   disease   susceptibility.   
•  the   silencing   of   the   target   gene   may   not   only   stop   the   manufacture   of   the   gene   product   
(ie   protein),   but   depending   on   the   possible   involvement   of   this   protein   in   other   
pathways,   may   cause   other   unpredicted   effects   (often   referred   to   as   pleiotropic   
effects).   Consequences   may   include   anything   that   is   linked   to   those   pathways,   eg   
growth   factors,   defence   and   signalling   mechanisms,   accumulation   of   compounds,   etc.   
•  Specific   to   dsRNA:   Depending   on   the   methodology   used,   the   presence   of   dsRNA   
molecules   in   the   food   chain   and   the   environment   may   negatively   impact   other   
organisms   exposed   through   ingestion   or   contact,   for   example   in   the   case   of   sprays.   
They   cay   be   passed   down   the   food   chain,   and   may   be   amplified   and   lead   to   the   
switching   off   of   vital   genes,   which   could   have   wide   ecological   and   health   consequences.   
This   is   the   intended   outcome,   for   example,   with   insecticidal   dsRNAs   produced   in   
genetically   engineered   crop   plants.   This   is   a   new   and   serious   dimension   of   risk   as   
compared   to   older   GMOs.   
Conclusion:   The   crucial   question   is   not   whether   or   not   the   final   product   (the   plant)   
contains   DNA   sequences   inserted   through   genetic   engineering.   It   is   rather   that   RdDM   is   a   
very   new   and   little   understood   technology   with   potentially   serious   negative   impacts   both   
for   consumption   and   the   environment.   It   is   a   genetic   engineering   technology   that,   given   the   
risks,   needs   full   regulation   and   risk   assessments.   
                                                                                                                                                                        
17   A   methyl   group   (-­‐CH3   group)   is   made   up   of   one   carbon   linked   to   three   hydrogen   atoms.   
18   In   the   case   of   higher   organisms   like   plants   and   animals,   only   one   of   the   four   DNA   nucleotides,   the   cytosine   
base,   can   be   methylated.   In   lower   organisms   such   as   bacteria,   the   adenosine   nucleotide   can   also   be   methylated.   
Inherent   risks   and   the   need   to   regulate:   ‘New   Breeding   Techniques   (NBTs)   
6   

5)   Grafting:      of   non-­GMO   graft   (scion)19   on   GMO   rootstock;   (and   vice   versa)   
Grafting   (eg   of   fruit   trees,   grapevines,   tomatoes)20   is   a   way   to   combine   the   strength   or   
desired   traits   of   two   organisms   into   one,   without   having   to   cross-­‐breed   them,   eg   rootstock   
for   disease   resistance   and   the   graft   or   scion   for   fruit   flavour.   Though   in   combination   a   
chimera   (a   single   organism   composed   of   genetically   distinct   cells),   the   graft   and   rootstock   
in   themselves   will   largely   keep   their   own   genetic   identities   with   regard   to   the   basic   
sequence   of   their   DNA.   
The   aim   of   using   a   GM   rootstock   is   to   create   grafts   that   would   benefit   from   the   GM   
characteristics   without   being   defined   as   GM   or   sharing   the   GM   DNA,   though,   as   a   whole,   the   
plants   are   GM.   
Thus,   strictly   speaking,   the   tissue   of   the   graft   would   not   have   been   genetically   engineered,   
while   the   rootstock   has.    Yet   many   of   the   molecules   produced   by   the   GM   rootstock,   whether   
proteins,   certain   types   of   RNA   (eg:   dsRNA),   hormones,   signalling   or   defence   molecules,   can   
spread   throughout   the   whole   of   the   chimeric   plant.21         
Unintended   changes   and   risks:   
•  impact   of   the   GM   rootstock   on   the   environment:   genetic   engineering   processes,   such   
as   transformation   and   tissue   culture   (see   footnote   1),   are   known   to   induce   genome   
wide   mutations,   as   well   as   insertion   site   mutations.   These   can   lead   to   altered   and   
unexpected   traits,   potentially   with   negative   impacts   on   soil   and   environment.   
Positional   effects   of   inserted   genes   (e.g.:   affecting   the   expression   of   neighbouring   
genes)   may   equally   lead   to   negative   impacts.   
•  Compounds   and   metabolites   produced   by   the   GM   rootstock   will   be   present   in   the   graft   
and   its   products   (eg   in   fruit)   and   may   alter   the   composition   of   the   fruit/product,   
which   in   turn   may   alter   the   nutrient,   allergen   or   toxin   composition.   
•  If   RNAi   (RNA   interference)   methodology   has   been   used   in   the   GM   rootstock,   the   gene   
silencing   active   in   the   DNA   of   the   rootstocks   could   transfer   to   the   DNA   of   the   graft   via   
the   movement   of   small   RNA   molecules   from   the   rootstock   into   the   graft.   This   may   
silence   genes   in   the   graft   and   alter   its   traits   and   vice   versa.   
Conclusion:   To   obtain   the   GM   chimeric   plant,   by   definition,   requires   genetic   engineering,   
and   the   risks   arising   are   due   to   the   genetic   engineering   (the   inserted   sequence,   its   location   
and   the   transformation   processes).    The   fact   that   the   graft   does   not   have   any   of   the   
genetically   modified   DNA   does   not   necessarily   reduce   the   risks   to   the   environment,   
ecosystems   and/or   human   and   animal   health.    As   molecules/compounds   can   travel   
between   rootstock   and   graft,   affecting   the   behaviour   and   molecular   composition   of   the   
graft,   both   the   plant   as   a   whole   and   the   graft   and   its   products   need   to   be   defined   as   GM   and   
fully   assessed   and   regulated.   This   is   particularly   the   case   as   the   processes   and   interaction   
between   rootstock   and   grafts   are   still   poorly   understood.   
                                                                                                                                                                        
19      Scion:      A   young   part   of   a   plant   (shoot,   twig   or   bud)   that   has   been   cut   for   grafting.   
20   Grafting:   has   been   common   for   woody   plants   for   over   2000   years,   and   is   often   used   for   fruit   trees,   roses   
and   grapevine.    Grafting   of   vegetables   is   more   recent,   mostly   used   for   tomatoes   and   watermelon,   but   also   
cucumbers   and   eggplant.   
21   the   transport   is   especially   via   the   phloem,   which   is   a   type   of   vessel   tissue   that   transports   water,   food   and   
nutrients   up   and   down   (ie   in   both   directions)   to   growing   parts   of   the   plant.   
EcoNexus   December   2015   
   
   
   
7   

6)   Reverse   breeding   (RB)   
RB   is   a   GM   technology   intended   to   reconstitute   genetically   uniform   and   pure   (homozygous)   
parental   lines   from   an   existing   hybrid   whose   parental   lines   are   no   longer   available   or   no   
longer   exist.   A   major   hurdle   in   this   is   that,   every   time   gametes   (reproductive   cells)   are   
produced,   the   chromosomes   previously   acquired   from   the   parental   lines   swap   information   
during   the   genetic   recombination   stage22,   thus   mixing   the   DNA.   To   avoid   this,   the   selected   
hybrid   seed   is   genetically   engineered   to   suppress   genetic   recombination   (using   RNAi).   
With   the   help   of   tissue   culture,   individual   resulting   gametes   are   used   to   reconstitute   plants   
with   two   sets   of   the   same   chromosomes   (called    ‘double   haploid’).   At   a   later   stage   the   GM   
gene   is   deselected   and   parental   lines   chosen   that   –   in   combination   –   will   give   rise   to   the   
envisaged   hybrid.   
Unintended   changes   and   risks:   
•  As   the   same   genetic   engineering   processes   are   used,   both   to   insert   genes   and   to   
reconstitute   plants   through   tissue   culture,   the   same   risks   and   unpredictable   outcomes   
are   possible   as   with   other   GM.   There   will   usually   be:   
o  insertion   site   and   genome   wide   mutations   (eg   deletions,   rearrangements,   
multiplications)   resulting   from   the   transformation   processes,   including   tissue   
culture,      with   unpredictable   consequences   that   could   lead   to   altered   performance   
and   disease   susceptibility,   accumulation   of   toxins,   increased   production   of   allergens,   
changes   in   nutritional   composition.      
o  The   vast   majority   of   these   mutations   would   remain   present   in   the   reconstituted   
parental   lines   even   if   the   GM   gene   itself   is   deselected   and   with   it   the   mutations   most   
closely   associated   with   the   insertion   site   itself.   
•  The   GM   gene   silencing   method   of   RNAi   may   lead   to   non-­‐target   gene   silencing   of   other   
genes,   effects   that   will   be   maintained   for   many   generations   of   seed.   Thus   tests   for   
performance   and   compositional   analysis   will   need   to   be   carried   out,   followed   by   full   
risk   assessments.   These   need   to   take   place   before   initial   planting,   but   also   several   
generations   later,   once   the   intended   and   unintended   gene   silencing   has   faded   and   it   
should   include   feeding   trials.   
•  Functional   components   or   full   sequences   of   the   GE   gene   may   have   integrated   
themselves   elsewhere   in   addition   to   the   primary   insertion.   They   may   thus   not   be   
removed   in   the   de-­‐selection   process,   leaving   them   potentially   still   able   to   initiate   gene   
silencing   in   the   target   region   or   in   off-­‐target   areas.   
Conclusion:      Parental   lines   as   well   as   the   combined   new   hybrids   need   to   be   tested   for   the   
presence   of   GE   sequences   as   well   as   for   unintended   effects   due   to   off-­‐target   gene   silencing   
and   transformation   induced   mutations,   which   have   the   potential   to,   for   example,   result   in   
altered   performance   and   disease   susceptibility,   accumulation   of   toxins,   increased   
production   of   allergens,   changes   in   nutritional   composition.   Full   risk   assessments   are   
required.   
   
   
   
   

                                                                                                                                                                        
22      Meiosis   is   a   process   of   cell   division   resulting   in   gametes,   i.e.   the   male   or   female   reproductive   cells,   each   
containing   half   the   number   of   chromosomes   (haploid)   as   compared   to   the   ordinary   plant   cells   (diploid),   that   
has   two   sets   of   chromosomes,   one   from   each   parent.   
Inherent   risks   and   the   need   to   regulate:   ‘New   Breeding   Techniques   (NBTs)   
8   

7)   Agro-­infiltration:   Agro-­infiltration   ‘sensu   stricto’   &   Agro-­infection   
This   method   involves   two   distinct   technologies.   It   is   not   intended   to   result   in   specific   GM   
genes   being   stably   inserted   and   integrated   into   a   plant   genome,   but   rather   for   such   genes   to   
be   present   within   the   plant   cell   transiently,   for   a   maximum   of   just   one   generation.      
To   this   end,   genes   either   coding   for   specific   proteins   or   for   RNAs   to   interfere   with   the   
plant’s   own   genes   (eg   via   RNAi)   are   engineered   into   the   plasmid23   of   Agrobacterium   
tumefaciens.24    A   solution   of   such   Agrobacteria   or   their   plasmids   is   then   used   to   treat   
specific   tissues   of   living   plants   (eg   leaves)   so   as   to   have   the   plasmids   with   the   GM   genes   
delivered   to   the   cells   in   that   tissue,   where   these   genes   will   be   expressed   in   the   specific   RNA.   
The   aims   may   be   to:   test   potential   transgenes;   study   the   function   of   the   plant’s   own   genes   
(eg   through   gene   silencing   via   RNAi);   express   and   produce   high   value   proteins   in   plants   (eg   
pharmaceuticals);   produce   plants,   seeds,   hybrids   with   altered   traits   through   RdDM   (RNA   
dependent   DNA   methylation   –   see   section   4);   or   use   as   a   delivery   system   for   other   GM-­‐
based   NBT   tools,   such   as   site   directed   nucleases.   
Two   distinct   technologies:   
Agro-­‐infiltration   ‘sensu   stricto’   (ie   in   the   narrowest   meaning):   The   intention   is   to   keep   the   
gene   expression   and   effect   localised,   thus   the   genetic   construct   prepared   and   used   is   not   
expected   to   replicate   in   the   receiving   cell.   
Agro-­‐infection:   The   intention   is   to   spread   the   specific   GM   gene   throughout   the   whole   plant   
into   almost   all   the   tissues,   but   without   integrating   the   gene   into   the   plant’s   DNA.   For   this   
purpose,   in   addition   to   the   chosen   gene,   the   gene   construct   contains   a   viral   vector   
sequence   in   order   to   replicate   the   construct   in   all   infected   cells.   The   gene   for   the   RNA   is   
meant   to   be   expressed   from   its   location   on   the   vector,   ie   not   from   a   location   on   the   
plant’s   DNA.   
Unintended   changes   and   risks:   
•  Though   applied   locally,   the   gene   construct   can   spread   throughout   the   plant,   due   to   the   
agrobacteria   and/or   the   viral   vector   sequences   used.   Although   meant   to   be   transient,   
the   genetic   material   may   become   integrated   into   the   plant’s   DNA,   including   
reproductive   tissue,   thus   unintentionally   giving   rise   to   GMOs   and   to   GM   progeny.   
•  Integration   may   happen   at   random   places   within   the   genome   and   may   also   involve   any   
of   the   DNA   sequences   introduced,   including   vector   DNA.   Disruption   of   genes   due   to   
positional   effects   or   due   to   sequences   present   in   the   gene   construct   could   give   rise   to   
negative   impacts   on   plant   performance,   environment   and   biodiversity,   or   on   its   safety   
as   food.   
•  Accidental   release   of   genetically   engineered   Agrobacteria   into   the   environment   could   
occur   (either   due   to   the   spread   of   and   contamination   from   infiltrated   plant   material   
that   has   been   discarded   or   removed,   or   simply   through   spillage,   eg   from   lab,   
greenhouse   or   test   plots).      This   in   turn   could   give   rise   to   adverse   effects   if   the   gene   
constructs   get   transferred   to   other   plants   or   to   microorganisms.   
•  Replication   can   occur   at   levels   too   low   to   detect   for   long   periods   of   time,   increasing   the   
chance   for   either   integration   or   mutation   that   makes   the   DNA   stably   heritable.   
Conclusion:   plants   subjected   to   Agro-­‐infiltration   (including   agro-­‐infection),   along   with   any   
of   their   parts   and   products   as   well   as   their   progeny   need   to   be   tested   for   the   presence   of   
DNA   sequences   from   the   vector   and/or   the   gene   construct,   as   well   as   for   the   presence   
and   effects   of   gene   silencing,   if   that   was   the   initial   aim   of   the   agro-­‐infiltration.      
                                                                                                                                                                        
23      A   plasmid   is   a   circular   ring   of   DNA   in   a   bacterial   cell   that   can   replicate   independently   of   the   chromosomes   
and   can   be   passed   on   to   other   bacteria.   Here   it   contains   the   transgenes.   
24   Using   Agrobacterium   as   a   gene   shuttle   is   one   of   the   major   means   of   performing   GM).   
EcoNexus   December   2015   
   
   
   
9   

For   background   information   and   further   reading,   four   of   the   most   important   
references:   
   
Eckerstorfer   M,   Miklau   M   and   Gaugitsch   H.   (2014).   New   plant   breeding   techniques   and   
risks   associated   with   their   application.   Technical   Report.   REP-­‐0477.   Environmental   Agency   
Austria.      ISBN:   978-­‐3-­‐99004-­‐282-­‐3   
http://www.umweltbundesamt.at/fileadmin/site/publikationen/REP0477.pdf   
   
Heinemann   JA,   Agapito-­‐Tenfen   SZ,   and   Carman   JA.    (2013).    A   comparative   evaluation   
of   the   regulation   of   GM   crops   or   products   containing   dsRNA   and   suggested   improvements   
to   risk   assessment.   Environment   International   55: 43–55   
http://gmojudycarman.org/wp-­‐content/uploads/2013/06/comparative-­‐evaluation-­‐of-­‐
the-­‐regulation-­‐of-­‐GM-­‐crops-­‐or-­‐products-­‐containing-­‐dsRNA-­‐and-­‐suggested-­‐improvements-­‐
to-­‐risk-­‐assessments.pdf   
   
Wilson   AK,   Latham   JR   and   Steinbrecher   RA.   (2006).   Transformation-­‐induced   mutations   in   
transgenic   plants:   analysis   and   biosafety   implications.   Biotechnology   and   Genetic   
Engineering   Reviews
   23:209–237   
http://econexus.info/publication/transformation-­‐induced-­‐mutations-­‐transgenic-­‐plants   
   
Agapito-­‐Tenfen,   SZ   and   Wikmark,   O-­‐G   (2015).   Current   status   of   emerging   technologies   for   
plant   breeding:   Biosafety   and   knowledge   gaps   of   site   directed   nucleases   and   
oligonucleotide-­‐directed   mutagenesis.   GenØk   Biosafety   Report   02/15.      
http://genok.com/arkiv/4288/   
   
   
Inherent   risks   and   the   need   to   regulate:   ‘New   Breeding   Techniques   (NBTs)   
10