Esta es la versión HTML de un fichero adjunto a una solicitud de acceso a la información 'Request to EFSA for scientific opinion on "new GMOs"'.



Document 16
Aan de staatssecretaris van 
Infrastructuur en Milieu 
Mevrouw W.J. Mansveld 
Postbus 20901 
2500 EX Den Haag 
DATUM 
30 oktober 2014 
KENMERK 
CGM/141030-01 
ONDERWERP 
Signalering en advies CRISPR-Cas; revolutie uit het lab 
Geachte mevrouw Mansveld, 
Hierbij bied ik u de signalering en advies ‘CRISPR-Cas; revolutie uit het lab’ aan. 
Samenvatting: 
In de afgelopen jaren zijn grote vorderingen gemaakt met technieken waarmee gerichte 
veranderingen in het genoom kunnen worden aangebracht. Eén van de meest veel-
belovende technieken is CRISPR-Cas. Dit genome  editing  systeem vindt in zeer korte 
tijd grootschalige toepassing in alle onderzoeksvelden van de levenswetenschappen. Met 
behulp van CRISPR-Cas kunnen gerichte veranderingen zoals mutaties, deleties en 
zowel kleine als grote inserties (transgenen) in het genoom worden aangebracht. 
CRISPR-Cas biedt grote kansen en mogelijkheden voor medische toepassingen, 
plantenveredeling en innovatie in de levenswetenschapen. Echter de EU ggo-
regelgeving is niet toegesneden op de nieuwe technologische mogelijkheden. Hierdoor 
ontstaan onder meer problemen rond handhaafbaarheid, ontstaat een ongelijk speelveld 
voor bedrijven in de EU met  bedrijven daarbuiten  en komen innovatie en weten-
schappelijk onderzoek in de knel. De snelle opmars en grote potentie van CRISPR-Cas 
zet deze problematiek op scherp. 
De mogelijkheid om gericht veranderingen in het genoom aan te brengen kan ook tot 
nieuwe (ethische) vragen leiden, zoals waarom het niet toegestaan is om erfelijke 
ziekten bij de mens uit te bannen door genetische modificatie.  
In de signalering wordt ingegaan op de technische aspecten van het CRISPR-Cas 
systeem, de mogelijkheden die het systeem biedt voor zowel medische als 
landbouwkundige toepassingen, de eventuele risico’s en de vraag of CRISPR-Cas 
toepassingen en hun producten onder de ggo-regelgeving vallen. Daarnaast wordt 
ingegaan op de noodzaak dat de EU tot een snel besluit komt over de status van de 
nieuwe biotechnologische technieken in het algemeen, en CRISPR-Cas in het bijzonder, 
en over de noodzaak van een eventuele herziening van de EU ggo-regelgeving. 



 De door de COGEM gehanteerde overwegingen en het hieruit voortvloeiende signalering en 
advies treft u hierbij aan als bijlage. 
 
 
Hoogachtend, 
 
Prof. 
 
COGEM 
 
c.c.    
 
Drs. 
  
, Ministerie van IenM  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 link to page 20 CRISPR-Cas, revolutie uit het lab 
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
 
1. Inleiding 
In de afgelopen jaren zijn er grote vorderingen gemaakt met technieken om gericht veranderingen 
in het erfelijk materiaal aan te brengen (‘gene of genome editing’). Deze nieuwe technieken leiden 
tot vragen over de grenzen en reikwijdte van de regelgeving voor genetisch gemodificeerde 
organismen (ggo’s). De COGEM heeft eerder in verschillende signaleringen en adviezen aandacht 
gevraagd voor deze nieuwe ontwikkelingen.  
 
Een nieuwe technologie  gebruik makend van het Clustered Regularly Interspaced Short 
Palindromic Repeat (CRISPR)-associated protein (Cas), kortweg aangeduid met CRISPR-Cas  of 
CRISPR, lijkt tot een stroomversnelling te leiden. In zeer korte tijd heeft CRISPR zijn weg 
gevonden  in tal van  onderzoeksvelden.1  Het CRISPR-Cas systeem berust op de herkenning van 
specifieke sequenties in het genoom en het gebruik van een nuclease om breuken in het DNA aan 
te brengen. 
 
1.1 Historie van genome editing 
In 2002 werd voor het  eerst  de mogelijkheid beschreven  om in de levende cel met behulp van 
sequentie specifieke nucleasen gerichte modificaties in het DNA aan te brengen. Er zijn sindsdien 
verschillende van deze nucleasen ontdekt, zoals zinc finger nucleasen, Transcription Activator-Like 
Effector Nucleases (TALENs) en het CRISPR-Cas systeem, waarbij het Cas9 eiwit de breuk in het 
DNA aanbrengt.2 
 
In 2002 werden de zinc finger nucleasen voor het eerst gebruikt om specifieke veranderingen in het 
genoom van fruitvliegen (Drosophila melanogaster) aan te brengen.3  In 2005 werden deze 
zinkvingernucleasen gebruikt om een mutatie te herstellen in humane cellen.4  Vanaf 2008 werd 
deze techniek voor steeds meer toepassingen gebruikt. De COGEM heeft in 2009 een signalering 
uitgebracht over de toepassingen van zinkvingers.5  
 
In 2010 is voor het eerst de toepassing van TALENs in gist beschreven.6  Vanaf 2011 is deze 
techniek onder andere toegepast om veranderingen in de genomen van Arabidopsis thaliana
Caenorhabditis elegans en humane cellen aan te brengen.7,8,9,10 
 
In 2012 is voor het eerst de toepassing van het CRISPR-Cas systeem beschreven. Sindsdien zijn er 
in korte tijd veel wetenschappelijke artikelen gepubliceerd met toepassingen waarbij dit systeem 
gebruikt wordt (zie tabel 1). Het is bijvoorbeeld mogelijk om humane stamcellen minder gevoelig 
te maken voor een infectie met HIV-1,  genetische defecten te herstellen, en genen in en uit te 
schakelen in planten  of dieren.11,12,13,14  Het  CRISPR-Cas  systeem is veelbelovend en kan voor 
zowel de medische sector als de plantenbiotechnologie van groot belang worden.  
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 21 link to page 21 link to page 21 De technologie biedt voordelen ten  opzichte van  eerder bestaande technieken als zinkvingers en 
TALEN, omdat er geen kennis van eiwittechnologie noodzakelijk is, protocollen om een CRISPR-
Cas molecuul te maken relatief eenvoudig zijn, en de moleculen snel te synthetiseren zijn. Tal van 
fabrikanten bieden kits aan voor gene-editing met behulp van CRISPR-Cas.  Hierdoor wordt 
genome editing een standaardtechniek beschikbaar voor elk onderzoekslaboratorium. 
 
Het potentieel van deze technologie en de 
Tabel 1: Aantal  wetenschappelijke  publicaties 
snelle verspreiding binnen de onderzoeks-
over het CRISPR-Cassysteem1 
wereld blijkt uit de exponentiële stijging 
2010   
0   
van het aantal publicaties over CRISPR-
2011   
 

Cas. Ook in Nederland wordt deze 
2012 

techniek gebruikt. 
2013 
100 
 
20142  
235 
Deze signalering gaat in op de manier 
1) zoektermen in PubMed: CRISPR Cas9 
waarop het CRISPR-Cas  systeem werkt, 
2) tot 30/9/2014  
de mogelijke toepassingen van dit 
systeem, de eventuele (milieu)risico’s, in hoeverre de ggo-regelgeving van toepassing is  op  deze 
nieuwe technologie en welke knelpunten er in de ggo-regelgeving ontstaan door de opkomst van 
CRISPR-Cas.     
 
 

2. Het CRISPR-Cas systeem 
Het  CRISPR-Cas  systeem kan specifieke DNA sequenties herkennen en kan daarom gebruikt 
worden om het erfelijk materiaal gericht te veranderen. Het is met dit systeem mogelijk om 
genexpressie te reguleren, (delen van) genen te verwijderen, nieuwe genen of DNA fragmenten te 
introduceren of om locaties van bepaalde sequenties binnen het genoom zichtbaar te maken. Het 
CRISPR-Cas systeem is specifiek, efficiënt en relatief gemakkelijk te gebruiken.  
 
2.1 Het CRISPR-Cas systeem is afkomstig uit bacteriën 
Het  CRISPR-Cas  systeem is afkomstig van Streptococcus pyogenes  en  is deel van het 
afweersysteem  of immuunsysteem van  deze  bacterie. Soortgelijke systemen zijn ontdekt in 90% 
van de Archaea (oerbacteriën die net als bacteriën geen celkern hebben en waarvan het afschrijven 
van genen lijkt op dat van eukaryoten die wel een celkern hebben) en 40% van de bacteriën.15,16,17  
 
Het CRISPR-Cas systeem bestaat uit twee RNA moleculen en een eiwit. Het eerste RNA molecuul 
kan aan een specifieke DNA volgorde van 20 nucleotiden binden, het tweede RNA molecuul bindt 
aan het eerste en kan vervolgens het Cas9 eiwit binden. Wanneer er een protospacer adjacent motif 
(PAM) aanwezig is naast de sequentie waaraan het eerste RNA aan bindt, klieft het Cas9 eiwit het 
dubbelstrengs DNA molecuul doormidden en veroorzaakt daarmee een dubbelstrengsbreuk in het 
DNA.  Hiervoor  beschikt  het Cas9 eiwit  over  twee verschillende nucleasen die beide één van de 
DNA strengen knipt. De PAM sequentie bestaat uit de bases NGG, waarbij de N alle basen kunnen 
zijn.  
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 22 link to page 22
2.2 Toepassing van het CRISPR-Cas systeem als ‘genome editing tool’ 
In 2012 is beschreven dat beide RNA moleculen gecombineerd als één ‘single guide’  RNA 
(sgRNA) werkzaam is in bacteriën  (figuur 1).18  In 2013 is ontdekt dat deze toepassing ook in 
eukaryote cellen toegepast kan worden.19  De laatste ontdekking zorgde voor een snelle  toename 
van onderzoek naar het CRISPR-Cas systeem. De toepassing van CRISPR-Cas als gene of genome 
editing systeem berust op de mogelijkheid om gericht op specifieke plaatsen in genoomsequenties 
breuken aan te brengen,  en op het gebruik van de cellulaire DNA-reparatiemechanismen om 
mutaties en deleties aan te brengen of nieuwe sequenties in te bouwen. 
 
 
Figuur 1: Het CRISPR-Cas systeem  
 
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 6 link to page 6 link to page 6 link to page 6 link to page 23 link to page 23 link to page 23 link to page 23 link to page 23 2.2.1 DNA herstelmechanisme repareert een dubbelstrengsbreuk 
Aangezien een breuk in het DNA dodelijk kan zijn voor een cel, treedt een van nature aanwezig 
DNA-herstelmechanisme in werking om de breuk te repareren.20  Een cel heeft hiervoor 
verschillende mechanismen tot zijn beschikking, namelijk ‘homologous directed repair’ (HDR) en 
non-homologous end-joining’ (NHEJ) (zie kader).  
 
Homologous directed repair (HDR) 
Homologe recombinatie is een zeer precies mechanisme om breuken in het DNA te 
herstellen.20  Het vormt een soort copy-paste  proces waarbij een niet-beschadigde 
homologe DNA-sequentie als informatiebron voor het herstel dient.20 Als homologe DNA 
sequentie kan een vergelijkbare sequentie in het genoom dienen, bijvoorbeeld de 
sequentie op de zusterchromatide.20  
 
Non-homologous end-joining (NHEJ) 
Een andere manier waarop een dubbelstrengsbreuk hersteld kan worden, berust op het aan 
elkaar plakken van de gebroken DNA strengen, het zogenaamde non-homologous end-
joining. Dit vergt geen of zeer weinig sequentiehomologie, en resulteert vaak in deleties 
of inserties op de plaats van de breuk.20,21,22 
 
Het is met het CRISPR-Cas systeem mogelijk om specifieke mutaties of genen in een genoom te 
introduceren door middel van homologe recombinatie  (HDR). Hiervoor moet gedurende de 
modificatie naast het  sgRNA en het  Cas9 gelijktijdig een DNA molecuul ingebracht worden dat, 
aan weerszijden van de ‘in te brengen’ sequentie, een grote mate van sequentie-overeenkomst 
vertoont met de sequenties aan beide zijden van de dubbelstrengsbreuk.23 Daarnaast is het mogelijk 
om met behulp van CRISPR-Cas kleine inserties en deleties (indels) in het genoom te introduceren, 
doordat een aangebrachte breuk in het DNA via  het mechanisme van NHEJ zal worden 
gerepareerd. 
 
2.2.2 Het CRISPR-Cas systeem in eukaryote cellen 
Om gerichte veranderingen in het genoom van eukaryote cellen te kunnen aanbrengen, moet er een 
methode of techniek zijn om het CRISPR-Cas systeem in de cel te brengen. Daarnaast hebben 
eukaryoten  in tegenstelling tot prokaryoten (zoals bacteriën en archaea) een celkern. Het Cas9 
wordt daarom van een signaal voorzien om het naar de celkern te transporteren.  
 
Welke methode het meest geschikt is om de elementen van het CRISPR-Cas systeem in eukaryote 
cellen te introduceren, is onder meer afhankelijk van het type cel en het organisme waarin het 
geïntroduceerd moet worden. Voor zoogdiercellen zijn er andere methoden dan voor plantencellen.  
Bij planten wordt voornamelijk gebruik gemaakt van de bacterie Rhizobium radiobacter (voorheen 
Agrobacterium tumefaciens).24  Uit een getransformeerde cel kan vervolgens een plant gekweekt 
worden. Het CRISPR-Cas systeem kan ook constitutief in de cel tot expressie gebracht worden met 
behulp van een transformatievector die niet in het genoom ingebouwd wordt. Voor sommige 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 6 link to page 6 link to page 24 link to page 24 link to page 24 plantensoorten is het mogelijk om het CRISPR-Cas complex in protoplasten in te brengen (zonder 
tussenkomst van een vector of R. radiobacter) en uit de protoplasten een plant te laten ontwikkelen. 
Ook wordt gewerkt aan vectorsystemen gebaseerd op plantenvirussen om het CRISPR-Cas9 
systeem in plantencellen te introduceren.25  
 
Voor de introductie in zoogdiercellen worden verschillende methoden gebruikt om het CRISPR-
Cas systeem in een cel te brengen. Een veel gebruikte methode is het inbrengen van een plasmide 
of andere DNA vector  dat het gen coderend  voor het Cas9 eiwit bevat  en voor de productie van 
sgRNA zorgt.23,26 Een andere methode is om het sgRNA (of beide afzonderlijke RNAs) samen met 
het mRNA dat codeert voor het Cas9 eiwit in de cel in te brengen.27 Een derde methode bestaat uit 
het injecteren van het complex dat zowel het Cas9 eiwit als het sgRNA bevat.21  
 
2.2.3 CRISPR-Cas sequenties niet aanwezig in het uiteindelijke organisme 
Naast de aangebrachte veranderingen in het genoom van de cel, zullen in een aantal gevallen ook 
de elementen van het CRISPR-Cas systeem (Cas9 gen en sgRNA coderende sequentie) zelf in het 
genoom ingebouwd worden. Dit is bijvoorbeeld het geval wanneer een plantencel  genetisch 
gemodificeerd wordt en uit die cel een plant wordt opgekweekt. Echter in de meeste gevallen zal in 
het uiteindelijke organisme geen van de elementen van het CRISPR-Cas systeem meer aanwezig 
zijn. Ook bij het hierboven genoemde voorbeeld van de genetische gemodificeerde plant, ontstaan 
door middel van R. radiobacter-transformatie, kan na uitkruising de ingebouwde CRISPR-Cas 
sequenties kwijt geraakt worden door met nakomelingen verder te gaan die het construct niet 
bevatten, maar wel de gewenste genoomverandering. Eventuele herkenning of detectie van deze 
organismen is dan ook alleen mogelijk indien bekend is welke precieze veranderingen in het 
genoom zijn aangebracht. 
 
 
3. Toepassingen van het CRISPR-Cas systeem 
Genetische modificatie heeft de laatste jaren een sterke ontwikkeling doorgemaakt. 
Wetenschappers zijn steeds op zoek naar modificatietechnieken die efficiënter en specifieker zijn. 
Met het CRISPR-Cas systeem is een techniek beschikbaar gekomen waarmee het mogelijk is om 
op elke gewenste plek in het genoom de juiste verandering aan te brengen. 
 
Het is met behulp van CRISPR-Cas mogelijk om op specifieke locaties in het genoom (figuur 2): 

kleine en grote deleties aan te brengen, 

puntmutaties aan te brengen, 

sequenties of genen in te bouwen. 
 
 
 
 
 
 

COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24
Figuur 2: Toepassingen van CRISPR-Cas 
 
 
Door één of beide nucleases van het Cas9 eiwit uit te schakelen, zijn variaties op deze toepassingen 
mogelijk:  

Wanneer één van de nucleases van het Cas9 eiwit uitgeschakeld is, kan er een 
enkelstrengsbreuk  in het DNA molecuul geïntroduceerd worden. Door gebruik te maken 
van twee verschillende doelsequenties kunnen specifieke delen uit het DNA molecuul 
verwijderd worden.28,29,30  
 
Ook is het mogelijk om de expressie van genen te beïnvloeden  zonder veranderingen  in 
genoomsequenties te induceren: 

Door gebruikt te maken van een Cas9 eiwit waarvan beide nucleases uitgeschakeld zijn, 
kan het wel aan het DNA binden, maar niet klieven. Wanneer aan het Cas9 specifieke 
domeinen  (activators  of  repressors)  gekoppeld zijn, kunnen genen gereguleerd 
worden.31,32,33,34,35,36 Ten behoeve van onderzoeksdoeleinden is het met deze techniek ook 
mogelijk om bepaalde locaties op het DNA molecuul zichtbaar te maken.  
 
Een verrassende ontwikkeling is dat CRISPR-Cas niet alleen ingezet kan worden als genome 
editing system, maar dat het ook aan (m)RNA kan binden en dit kan klieven:37 

Hiermee is het mogelijk om (m)RNA functies te onderzoeken, genexpressie te beïnvloeden 
zonder DNA sequenties te veranderen, maar ook om RNA virussen te bestrijden. 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 5 link to page 6 link to page 6 link to page 9 link to page 7 link to page 9 link to page 9 link to page 9 link to page 9 link to page 9 link to page 6 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 Met de mogelijkheid gerichte veranderingen in het genoom aan te brengen, komen tal van 
onderzoekstoepassingen (beter) binnen handbereik. De functie van genen kan onderzocht worden 
door ‘knock out’ van genen, door gensequenties te veranderen of genen in te brengen; de regulatie 
van genen en de daarbij betrokken elementen kan beter onderzocht  worden; ‘reverse genetics’ 
wordt vergemakkelijkt, etc.38   
 
Er zijn al veel experimenten uitgevoerd in cellijnen19,39,40,41, maar er zijn ook experimenten 
uitgevoerd met fruitvliegen42, zebravissen21,  zoogdieren22,41,43,44,45,46,47, niet-humane primaten27  en 
planten.48,49,50,51 De COGEM verwacht dat er de komende jaren veel onderzoek met deze techniek 
uitgevoerd wordt en dat het  snel tot  commerciële toepassingen kan komen. Opgemerkt moet 
worden dat het hier een nog jonge technologie betreft en dat in de komende jaren nieuwe nu nog 
niet voorziene toepassingen op zullen komen. Hieronder worden enkele toepassingen van het 
CRISPR-Cas systeem beschreven. 
 
3.1 Toepassingen van het CRISPR-Cas systeem in de medische sector 
Vooral op medisch gebied wordt veel onderzoek verricht naar het gebruik van CRISPR-Cas. In 
veel gevallen bevindt het onderzoek zich nog in de ontwikkelfase. Toch zijn er al een aantal studies 
beschreven waarbij CRISPR-Cas gebruikt is voor de genetische modificatie van zoogdieren, zoals 
muizen43,52, ratten43,44,45, vee53 en niet-humane primaten.46 CRISPR-Cas biedt voordelen boven de 
huidige systemen om genetisch gemodificeerde (gg-) dieren te produceren. Door een CRISPR 
construct in eencellige embryo’s te injecteren, kan een gg-dier verkregen worden. Dit betekent dat 
de ‘ontwikkeltijd’ verkort wordt van meer dan een jaar tot enkele weken.  
 
Eén studie beschrijft de genezing van  staar (cataract) bij muizen.22  Staar erft dominant over, 
zodoende zal het nageslacht van een muis met en een muis zonder staar de ziekte hebben. In het 
genoom van de muizen ontbreekt één basenpaar waardoor er voortijdig een stopcodon wordt 
geïntroduceerd en een korter eiwit wordt gemaakt wat staar veroorzaakt. Om dit probleem op te 
lossen hebben onderzoekers bevruchte muizeneicellen geïnjecteerd met de componenten van het 
CRISPR-Cas  systeem. Het gekozen sgRNA zorgt ervoor dat er een dubbelstrengsbreuk  ontstaat 
naast het ontbrekende basenpaar. De onderzoekers hebben laten zien dat herstel van de 
dubbelstrengsbreuk zowel door HDR als door NHEJ plaatsvindt. Bij ongeveer de helft (36 van de 
78 muizen) van de levend geboren muizenpups heeft genetische modificatie plaatsgevonden. Bij 
67% (24 van de 36 muizen) werd het effect van  de mutatie teniet gedaan, resulterende in goed 
zicht.  
 
Het CRISPR-Cas  systeem kan ook in volwassen dieren ingezet worden om een 
ziektemodelsysteem te ontwikkelen. Recent is aangetoond dat het mogelijk is om in levercellen van 
muizen oncogenen en tumour  suppressor  genen aan  en uit te schakelen, waardoor een 
modelsysteem voor leverkanker ontstaat.54  Daarnaast is het CRISPR-Cas  systeem  onlangs  ook 
toegepast om volwassen muizen te genezen van een erfelijke leveraandoening.55  
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 3 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 Toepassingen die een ziekte bij de mens kunnen genezen,  komen steeds dichter  bij. Er zijn 
verschillende onderzoeken gepubliceerd waarbij  een genetische afwijking die veroorzaakt wordt 
door een fout op één plaats in het genoom  gecorrigeerd is.14,56  Naast therapeutische toepassingen 
waarbij gendefecten worden gecorrigeerd, wordt ook gedacht aan de inzet van CRISPR-Cas om 
genregulatie te beïnvloeden. Verder wordt onderzocht of het systeem gebruikt kan worden als 
antiviraal middel.57  Of om bacteriën te bestrijden. Door CRISPR-Cas in te bouwen in een 
bacteriofaag,  (een virus dat enkel bacteriën infecteert), kunnen specifieke bacteriën worden 
opgespoord, of specifieke sequenties zoals antibioticaresistentiegenen of virulentiefactoren.58 
 
Voor de toepassing van CRISPR gebaseerde systemen als therapie moeten nog een aantal hordes 
overwonnen worden, zoals vermindering van aspecifieke activiteit door off-target  binding en de 
ontwikkeling van efficiënte vectorsystemen om de systemen in de doelcellen te bezorgen. Een 
combinatie van CRISPR-Cas met virale expressievectoren zoals nu al in gebruik en in 
ontwikkeling voor gentherapie, kan een oplossing bieden voor dit laatste.59 
 
3.2 Toepassing van het CRISPR-Cas systeem in de plantenbiotechnologie 
De eerste toepassingen van CRISPR-Cas bij planten zijn beschreven in 2013. Deels betroffen het 
publicaties waarin aangetoond wordt dat het systeem werkzaam is in plantencellen en dat mutaties 
of gensequenties geïntroduceerd kunnen worden in modelsystemen als Arabidopsis of Tabak.  
 
Voor  Arabidopsis  is onder meer gerapporteerd  dat het mogelijk is om een inactief gen zo te 
veranderen dat het actief wordt, en dat deze eigenschap overerft naar een volgende generatie. Het is 
mogelijk om deze verandering aan te brengen zonder dat er andere wijzigingen in het genomisch 
DNA aangebracht worden.60  
 
Naast modelsystemen wordt ook gewerkt aan belangrijke landbouwgewassen, zoals Tomaat61  of 
gewone tarwe (Triticum aestivum). Omdat dit laatste gewas hexaploïd is (42 chromosomen (2n = 
6x = 42)), is genetische modificatie een uitdaging. Veranderingen moeten op meerdere plaatsen in 
het genoom aangebracht worden. In een wetenschappelijke studie hebben onderzoekers laten zien 
dat het mogelijk is om gewone tarwe resistent te maken tegen de plantenziekte echte meeldauw 
door op meerdere chromosomen hetzelfde gen te modificeren. Ze hebben hierbij gebruik gemaakt 
van twee technieken, namelijk TALENs en het CRISPR-Cas systeem.62 Polyploïdie komt voor bij 
meerdere belangrijke landbouwgewassen. Een toepassing die het mogelijk maakt om dezelfde 
modificaties op meerdere chromosomen gelijktijdig aan te brengen, is daarom zeer interessant voor 
plantenbiotechnologen en veredelaars. 
 
Daarnaast komen dezelfde genen soms meerdere keren voor op het genoom. Deze zogenaamde 
paraloge genen zijn ontstaan door duplicaties en bevatten grotendeels dezelfde sequentie. Het 
gelijktijdig kunnen aanbrengen van mutaties in alle relevante versies van deze paraloge genen biedt 
veredelaars de mogelijkheid de daarmee verbonden eigenschappen van de plant te wijzigen.  
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 6 link to page 11 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 Naast het wijzigen of inbrengen van gensequenties wordt ook gedacht aan het aanbrengen van 
mutaties in promotoren of andere regulatoire sequenties. Hierdoor kan de expressie van een gen 
verhoogd of verlaagd worden.  
 
De grote potentie van de techniek samen met de relatieve eenvoud en gebruikersvriendelijkheid 
van het systeem, maakt dat het CRISPR-Cas systeem in zeer korte tijd breed wordt toegepast in de 
onderzoekswereld en de veredelingsindustrie. Dit lijkt een voorbode  voor commerciële 
toepassingen in de landbouwsector. 
 
 
4. Risico’s van CRISPR-Cas 
Uit de wetenschappelijke literatuur blijkt dat er grote verwachtingen zijn van het CRISPR-Cas 
systeem. Over de eventuele risico’s verbonden aan CRISPR en ontwikkelde toepassingen is, mede 
gezien de nog relatief beperkte ervaringen, weinig gepubliceerd.  
 
4.1 ‘Off-target’ effecten  
Als  belangrijkste nadeel of risico van het CRISPR-Cas  systeem  worden mogelijke off-target 
effecten genoemd.63 Deze worden veroorzaakt doordat het sgRNA op de verkeerde plaats aan het 
erfelijk materiaal bindt. Wanneer het DNA vervolgens gekliefd en gerepareerd wordt, kunnen 
mutaties ontstaan op plaatsen waar dit niet de bedoeling is.22  Deze mutaties kunnen ongewenste 
effecten veroorzaken, zoals het veranderen van een eiwitmolecuul.  
 
De belangrijkste oorzaak van mogelijke off-target effecten is een mogelijk gebrek aan specificiteit 
van het sgRNA. De specificiteit moet dermate hoog zijn dat het erfelijke materiaal slechts op één 
plaats wordt herkend. Het sgRNA heeft een lengte van 20 nucleotiden. Gezien de grootte van het 
genoom van eukaryote organismen betekent dit dat deze bindingssequentie meerdere keren op het 
genoom kan voorkomen. Daarnaast kan het sgRNA soms ook op DNA sequenties binden die niet 
volledig identiek zijn. Wanneer de nucleotiden van het sgRNA verder van de PAM afligt is de kans 
hierop groter. In sommige gevallen is een overeenkomst van 15 van de 20 nucleotiden 
voldoende.64,65,66 Op deze locaties kunnen dubbelstrengsbreuken ontstaan die kunnen zorgen voor 
ongewenste mutaties.  
 
Eén van de belangrijkste manieren om off-target effecten te voorkomen, is te zorgen dat het sgRNA 
zo gekozen is dat het niet op een andere positie binnen het genoom kan binden. Dit kan door bio-
informatische analyse van de  genoomsequentie. Daarnaast zijn er computerprogramma’s  en  web-
tools beschikbaar die off-target binding kunnen voorspellen.67,68,69  
 
Verder blijkt dat het aantal off-target  effecten sterk afhangt van de experimentele condities, met 
name van de hoeveelheid (concentratie) van de aanwezige Cas9 eiwitten en sgRNAs. Hoge niveaus 
leiden tot meer off-target effecten.63 
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 

 

link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 Een andere methode om off-target effecten te voorkomen, is om één van de nucleasen van het Cas9 
eiwit uit te schakelen,  waardoor één van de twee DNA strengen gekliefd wordt. Op deze manier 
zijn, om het DNA molecuul doormidden te knippen, twee sgRNA/Cas9 complexen nodig die naast 
elkaar binden op de complementaire strengen om  een dubbelstrengsbreuk  te kunnen 
bewerkstelligen. Door deze methode zullen off-target effecten minder vaak voorkomen, omdat er 
nu twee bindingsplaatsen nodig zijn voor een dubbelstrengsbreuk. Daarnaast wordt ook onderzoek 
gedaan naar de mogelijkheden om de lengte van  het sgRNA te variëren om off-target effecten  te 
verminderen.70  
 
In hoeverre off-target effecten daadwerkelijk een risico vormen, is nog de vraag. Onderzoeken naar 
toepassing van CRISPR-Cas in stamcellen, lieten zien dat off-target effecten zeldzaam zijn.71,72,73,74 
De meeste gevonden genoomveranderingen, zoals deleties en inserties, zaten op willekeurige 
plaatsen in het genoom en waren niet het gevolg van de CRISPR-Cas toepassing, maar traden op 
gedurende de celkweek.   
 
4.2 Modificaties in het genoom  
Het  CRISPR-Cas systeem wordt gebruikt om veranderingen in het genoom van organismen te 
induceren. De op deze wijze geproduceerde organismen zullen inserties, deleties, puntmutaties, 
herschikkingen, of nieuwe sequenties en genen in hun genoom bevatten. Eventuele (milieu)risico’s 
of nadelige effecten die deze genoomveranderingen met zich meebrengen, zijn niet gerelateerd aan 
de methode waarmee deze veranderingen zijn te weeg gebracht, maar aan de aard van de 
veranderingen zelf. De eventuele risico’s moeten dan ook worden beoordeeld naar de aard van de 
verandering en niet als onderdeel van een veiligheidsbeoordeling van de techniek. 
 
 
5. Ggo-regelgeving en CRISPR-Cas 
Om mens en milieu te beschermen tegen potentiële ongewenste effecten bij werkzaamheden met 
ggo’s zijn Europese richtlijnen opgesteld. Deze richtlijnen zijn in de Nederlandse wetgeving 
geïmplementeerd via de Wet Milieubeheer, het Besluit GGO en de Regeling GGO. In de huidige 
wetgeving wordt een ggo gedefinieerd als een organisme, met uitzondering van de mens, waarvan 
het genetisch materiaal is veranderd op een wijze die van nature door voortplanting en/of 
natuurlijke recombinatie niet mogelijk is. Bovendien is er sprake van genetische modificatie als 
bepaalde technieken worden toegepast. Het betreft hier recombinant DNA-  en RNA-technieken 
waarbij gebruik wordt gemaakt van gastheer/vectorsystemen, technieken waarbij genetisch 
materiaal dat buiten het organisme is geprepareerd rechtstreeks in een organisme wordt gebracht 
(bijvoorbeeld via micro-injectie), en celfusie- of hybridisatietechnieken. 
 
De regelgeving voor ggo’s is opgesteld op basis van de stand van zaken van twintig jaar geleden. 
Destijds  is  een aantal technieken vrijgesteld van de regelgeving met als argument dat hiermee al 
jarenlange ervaring was opgedaan, zonder nadelige effecten. Sommige van deze technieken worden 
al sinds de jaren dertig van de vorige eeuw commercieel toegepast voor de veredeling van planten. 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
10 
 

link to page 24 link to page 24 Vrijgestelde technieken zijn celfusie  en protoplastfusie tussen kruisbare verwanten, zelfklonering 
van niet pathogene micro-organismen,  en het gebruik van chemische  mutagentia en straling om 
mutaties te induceren.  
 
De vraag is of alle toepassingen van het CRISPR-Cas  systeem onder de definitie van genetische 
modificatie en daarmee onder de regelgeving voor ggo’s vallen. Deze vraag is niet eenvoudig of 
eenduidig te beantwoorden. Mede omdat hierbij zowel juridische als wetenschappelijke 
argumenten een rol spelen.  
 
5.1 CRISPR-Cas producten kunnen niet eenduidig beoordeeld worden 
Een aantal overwegingen wijst erop dat CRISPR-Cas en de producten daarvan onder de vigerende 
ggo-regelgeving vallen. Bij het CRISPR-Cas systeem: 
1)  worden veranderingen in de sequentie van het genoom aangebracht op onnatuurlijke wijze, 
2)  wordt een ‘recombinant nucleïnezuurmolecuul’ (RNA al dan niet in combinatie met een eiwit 
(Cas9)) dat buiten het organisme is geprepareerd in de cel van het organisme gebracht, 
3)  wordt bij sommige toepassingen naast de gewenste genoomverandering ook onderdelen van het 
CRISPR-Cas systeem in het genoom ingebouwd, 
4)  wordt bij andere toepassingen een vectorsysteem, bijvoorbeeld gebaseerd op een genetisch 
gemodificeerd virus, gebruikt om het CRISPR-Cas in de cel van het doelorganisme te 
introduceren. 
 
Hier kan tegenin gebracht worden dat: 
1)  het aanbrengen van deleties, herschikkingen, puntmutaties en willekeurige kleine inserties ook 
spontaan in de natuur, of met behulp van chemische mutagentia of straling teweeg gebracht 
kunnen worden. De ‘klassieke’ mutagenese technieken zijn vrijgesteld van de ggo-regelgeving, 
omdat op grond van jarenlange ervaring de producten van deze technieken een ‘history of safe 
use’ hebben. Omdat het gericht aanbrengen van mutaties e.d. aanzienlijk minder risico’s met 
zich meebrengt dan induceren van willekeurige genoomveranderingen met mutagentia, heeft de 
COGEM eerder geadviseerd om ‘gerichte mutagenese’ ongeacht de methode vrij te stellen van 
de ggo-regelgeving.75 
2)  organismen met puntmutaties en indels  in het genoom niet te onderscheiden zijn van ‘niet 
gemodificeerde’ organismen. De handhaafbaarheid van de ggo-regelgeving komt daardoor 
onder druk te staan. De COGEM heeft er eerder op gewezen dat dit kan leiden tot een verlies 
aan vertrouwen in de overheid. 
3)  toepassingen van CRISPR-Cas om genexpressie te beïnvloeden waarbij de werking berust op 
binding aan regulatiesignalen en de Cas9 nuclease-activiteit is verwijderd, niet tot wijzigingen 
in de genoomsequentie leiden en derhalve niet onder de ggo-regelgeving kunnen vallen.  
 
Met betrekking tot de vraag of het sgRNA als recombinant nucleïnezuur beschouwd moet worden, 
is het eerdere COGEM advies en signalering “De status van oligonucleotiden in de context van 
gerichte mutagenese” van belang.76  Naar aanleiding van een adviesvraag van het voormalige 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
11 
 

ministerie van VROM definieerde de COGEM een oligonucleotide als ‘een enkel- of dubbelstrengs 
molecuul dat is opgebouwd uit de verschillende nucleotiden (of analogen daarvan) van het DNA 
en/of RNA met een lengte tot ongeveer 120 nucleotiden (of basenparen), dat al dan niet synthetisch 
is vervaardigd’.  De COGEM was van mening dat een oligonucleotide met een sequentie die 
identiek is aan, of slechts enkele nucleotiden verschilt van, genoomsequenties van de ontvangende 
cel niet als recombinant nucleïnezuur aangemerkt kan worden. Dit is een van de redenen dat de 
COGEM van mening is dat gerichte mutagenese met behulp van oligonucleotiden vrijgesteld kan 
worden van de ggo-regelgeving. 
Het sgRNA bestaat uit een combinatie van twee RNA moleculen. Het eerste deel bestaat uit een 
fragment van 20 nucleotiden dat gelijk is aan de bindingssite op het genomische DNA. Het tweede 
deel is noodzakelijk om het Cas9 eiwit te binden. De actieve delen van het RNA-eiwitcomplex 
worden dus gevormd door een RNA sequentie die gelijk is aan de genomische sequentie en een 
eiwit dat het DNA knipt. In lijn met de ggo-regelgeving en het eerder genoemde COGEM advies, 
kan gesteld worden dat op grond van deze elementen de ggo-regelgeving niet van toepassing is en 
het CRISPR-Cas gelijk gesteld kan worden met chemische mutagentia. Anderzijds bestaat het 
RNA molecuul aanwezig in het CRISP-Cas complex uit een combinatie van twee verschillende 
delen waarvan één deel geen sequentieovereenkomst heeft met het genomische DNA van de 
ontvangende cel. Hierdoor kan het sgRNA als ‘recombinant nucleïnezuur’ gekwalificeerd worden.  
 
5.2 Verschillende toepassingen vragen om een andere benadering 
Uit de bovenstaande paragraaf blijkt de, al eerder door de COGEM gesignaleerde, beperking van 
de huidige EU ggo-regelgeving. De Europese benadering dat organismen onder de ggo-regelgeving 
vallen indien er gebruik is gemaakt van bepaalde ‘recombinant DNA technieken’ komt in de knel 
bij nieuwe technieken als CRISPR. Indien CRISPR wordt toegepast om een transgen in een 
organisme in te bouwen, is er geen twijfel dat de ggo-regelgeving van toepassing is en dat het 
betreffende ggo een risicoanalyse moet ondergaan. Echter, wanneer CRISPR wordt toegepast om 
puntmutaties of indels te induceren zal het resulterende organisme ‘veiliger’ zijn dan een product 
gemaakt met behulp van ‘klassieke’ mutagentia. Vrijstelling van de regelgeving (zoals geldt voor 
producten van chemische mutagentia en straling) lijkt dan ook voor de hand te liggen. In hoofdstuk 
6 wordt hierop verder in gegaan. 
 
Indien CRISPR-Cas wordt toegepast als geneesmiddel om de expressie van een gen te beïnvloeden, 
door aan de sequentie te binden maar deze niet te modificeren, is dit vergelijkbaar met 
geneesmiddelen  die een effect hebben op genexpressie, en lijkt de ggo-regelgeving niet van 
toepassing. 
 
 
 
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
12 
 

link to page 13 link to page 13 link to page 15 link to page 24 6. Additionele overwegingen: mogelijke consequenties voor 
maatschappij, economie en beleid 
 
6.1 Maatschappelijke discussie 
De  maatschappelijke weerstand tegen genetische modificatie is gericht tegen toepassingen in de 
landbouw en bij voedsel. De discussie over nieuwe biotechnologietechnieken lijkt zich tot nu toe 
vooral te hebben afgespeeld binnen het domein van landbouwtoepassingen. Vrijstelling van ggo-
regelgeving of een andere beoordeling van de nieuwe technieken vond dan ook plaats binnen de 
context van een (veronderstelde) maatschappelijke afwijzing. De toepassing van CRISPR is veel 
breder, waarbij toepassingen in de medische sector zich mogelijk eerder zullen voordoen dan in de 
landbouwsector. Daarmee verandert mogelijk ook de maatschappelijke geladenheid van de 
discussie over de status van deze en vergelijkbare technieken. 
 
6.2 ‘Proces-gebaseerde’ regelgeving versus ‘product-gebaseerde’ regelgeving 
De COGEM heeft in de afgelopen jaren  verschillende keren aandacht besteed aan het feit dat de 
technologische ontwikkelingen niet langer in de pas lopen met de Europese regelgeving over 
genetische modificatie.75,76,77  
 
In de EU is gekozen voor specifieke regelgeving voor ggo’s. De EU regelgeving, zoals vastgelegd 
in EU Richtlijn 2001/18, wordt aangeduid als proces-gebaseerde regelgeving, omdat de wijze van 
productie (het proces) de aanleiding vormt voor regelgeving. Inherent aan dit soort regelgeving is 
dat de gebruikte technieken de scheidslijn voor de regelgeving vormen. 
 
In Noord-Amerika is er voor gekozen om ggo’s onder algemene al bestaande regelgeving te 
brengen. Dit soort regelgeving wordt aangeduid als product-gebaseerde regelgeving omdat de 
eigenschappen van het product of organisme bepalen of het gereguleerd moet worden. Met name in 
Canada geldt dat als bijvoorbeeld een gewas een nieuwe eigenschap heeft deze vergunningsplichtig 
is en veiligheidsbeoordelingen moet ondergaan, onafhankelijk of het gewas via conventionele 
veredeling of via genetische modificatie is ontstaan. Omgekeerd geldt hetzelfde, een gewas met een 
bekende eigenschap is nooit vergunningsplichtig.  
 
In de COGEM signalering “EU-regelgeving updaten?” wordt ingegaan op de achtergronden van 
deze regelgevingsystemen en een aantal opties geïnventariseerd om de kloof tussen de EU ggo-
regelgeving en de wetenschappelijke ontwikkelingen te overbruggen.77 
 
Ontwikkelingen als CRISPR-Cas versterken de roep om de EU regelgeving te schoeien op een 
product-gebaseerde leest. Een product-gebaseerde regelgeving hoeft niet aangepast te worden aan 
de technologische en wetenschappelijke ontwikkelingen.  
 
Het fundamenteel aanpassen van de EU-regelgeving  is, gezien het gepolariseerde klimaat in 
Europa rond genetische modificatie en de verdeeldheid tussen de verschillende EU-lidstaten over 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
13 
 

link to page 15 link to page 24 link to page 24 link to page 24 dit onderwerp, geen eenvoudige zaak. Daarnaast kunnen sommige toepassingen of producten die 
nu niet onder regelgeving vallen (want op conventionele wijze geproduceerd) dan wel 
vergunningsplichtig worden. Dit zal op weerstand uit onder meer het bedrijfsleven stuiten. 
 
Anderzijds vraagt een proces-gebaseerde regelgeving om een regelmatige herziening van juridische 
definities aangaande de technieken die onder genetische modificatie vallen of tot een ggo  leiden. 
Een technologie als CRISPR-Cas roept de vraag op of dit, - en zo ja, voor hoe lang nog -, mogelijk 
is. Daarnaast lijkt de besluitvorming in de EU hierover volledig vastgelopen. Mede naar aanleiding 
van de COGEM signalering over nieuwe plantenbiotechnologische technieken in 2006, heeft in 
opdracht van de Europese Commissie een EU werkgroep zich gebogen over de status van deze 
‘nieuwe’ technieken. Tevens is de EFSA gevraagd om de risico’s geassocieerd met deze technieken 
in kaart te brengen, en wordt een juridische analyse uitgevoerd. Zes jaar na de eerste bijeenkomst 
van de werkgroep, is nog steeds geen besluit genomen over de status van de nieuwe technieken.  
De vraag dringt zich op of het komen tot een besluit in de EU over de status van technieken niet 
een even moeizaam proces is als een totale herziening van de gronden van de regelgeving. 
 
Terwijl herziening en aanpassing van de regelgeving uitblijft, gaan de ontwikkelingen 
onverminderd voort, zoals blijkt uit CRISPR-Cas en TALEN. De kloof tussen wetenschap en 
regelgeving en de daarmee gepaard gaande problemen voor bedrijfsleven, wetenschappers en 
maatschappij worden steeds groter. 
 
Er is onduidelijkheid over wat als ggo beschouwd moet worden, waardoor het Europese 
bedrijfsleven afziet van bepaalde innovaties. Er ontstaat een ongelijk speelveld voor het Europese 
bedrijfsleven ten opzichte van het bedrijfsleven in Noord-Amerika. Handelsconflicten en 
importproblemen liggen op de loer, omdat de verschillen van inzicht tussen de EU en landen met 
een product-gebaseerde regelgeving over wat als ggo bestempeld en gereguleerd moet worden, zich 
verdiepen. Doordat bij import producten niet herkenbaar zijn als ggo volgens de Europese 
juridische definitie en mogelijk niet als zodanig geëtiketteerd worden, komt de keuzevrijheid van 
de Europese consument in het geding en de geloofwaardigheid van de overheid onder druk te 
staan.77 
 
6.3 Economische gevolgen  
De CRISPR-Cas techniek is in het werkveld omarmd als snelle en eenvoudige methodiek voor 
genome editing  bij zowel prokaryote als eukaryote organismen en in zowel het medische als 
landbouwkundige onderzoek. Ook biedt de techniek grote mogelijkheden voor industriële 
productie (‘witte biotechnologie’) vanwege de mogelijkheid om productieorganismen te 
verbeteren. CRISPR-Cas wordt ook gezien als een onmisbare techniek voor het opkomende veld 
van de synthetische biologie.78,79,80 CRISPR-Cas zal daardoor een belangrijke rol gaan spelen in de 
innovatie over de gehele breedte van de biotechnologie. Dit brengt ook aanzienlijke economische 
implicaties met zich mee.  
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
14 
 

link to page 17 link to page 24 link to page 24 link to page 24 link to page 24 Indien toepassingen van CRISPR-Cas binnen Europa anders beoordeeld (lees: vallend onder de 
ggo-regelgeving) worden dan buiten Europa, kan dit ertoe leiden dat zowel commerciële als 
onderzoeksactiviteiten verdwijnen uit de EU. De maatschappelijke weerstand tegen gg-gewassen 
en het moeizame vergunningenbeleid, heeft er toe geleid dat bedrijven in Europa zich niet langer 
bezig houden met genetische modificatie in landbouwgewassen, en dat er nog nauwelijks 
onderzoek op dit gebied gedaan wordt door universiteiten en onderzoeksinstellingen in de EU 
lidstaten. De (publieke en private) financiering voor dit soort onderzoeksactiviteiten is 
weggevallen.  
 
Eenzelfde scenario kan zich gaan voordoen rond nieuwe technieken als CRISPR. Bij genetisch 
modificatie van landbouwgewassen kan opgemerkt worden dat het slechts een deel van de markt 
trof, waarbij verdelingsbedrijven zich konden blijven richten op de conventionele veredeling. 
Daarbij hebben slechts een beperkt aantal lidstaten van de EU een significante 
plantenveredelingsindustrie. Technieken als CRISPR-Cas raken echter de gehele biotechnologie-
sector, inclusief de medische sector. De potentiële economische consequenties zijn daarmee veel 
groter.  
 
6.3.1 Intellectueel eigendom 
De situatie rond het intellectuele eigendom van deze technologie is nog niet uitgekristalliseerd.81,82 
In 2014 is een octrooi voor een CRISPR-Cas toepassing toegekend aan het start-up bedrijfje Editas 
Medicine.83  Verschillende andere instituten en wetenschappers hebben ook octrooiaanvragen 
ingediend over de technologie,  verbeteringen (zoals verhoogde specificiteit), en toepassingen. 
Onderzoekers van de University of Minnesota (VS) hebben een octrooiaanvraag ingediend over 
genome engineering  in planten.84  Waarschijnlijk zijn er veel meer octrooiaanvragen die nog niet 
gepubliceerd zijn.81  Ook moet er rekening mee gehouden worden dat eerder ingediende 
octrooiaanvragen op vergelijkbare technologieën of werkingsmechanismen van invloed kunnen 
zijn op de intellectuele eigendomssituatie van CRISPR-Cas.  
 
Onzekerheid over intellectueel eigendom of beheersing van de technologie door één of enkele 
personen of organisaties kan remmend werken op de implementatie van de technologie en ertoe 
leiden dat commerciële toepassingen langer op zich laten wachten dan nu verwacht. Het kan ook 
vragen of maatschappelijke weerstand oproepen, of een potentieel zo belangrijke technologie in de 
handen mag zijn van een kleine groep van wetenschappers, instituten of bedrijven. 
 
6.4 Kiembaangentherapie bij apen en mensen 
Het genetisch modificeren van mensen door zogenaamde kiembaangentherapie, waarbij 
nakomelingen genetisch aangepast worden, is niet toegestaan in Europa. Tegen genetische 
modificatie van mensen bestaan ethische bezwaren. Daarnaast spelen ook praktische bezwaren een 
rol. Het is onduidelijk of kiembaangentherapie mogelijk is (en met welke efficiëntie) en bovendien 
zijn de risico’s van (tot nu toe) willekeurige inbouw van het ingebrachte gen in het genoom van de 
nakomeling groot.  
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
15 
 

link to page 7 link to page 24 Begin 2014 publiceerden onderzoekers van het Model Animal Research Center of Nanjing 
University in China dat het hun gelukt was om apen genetisch te modificeren door met behulp van 
CRISPR-Cas gerichte mutaties aan te brengen in embryo’s.27  Verschillende onderzoeksgroepen 
hebben aangekondigd ook gg- apen te willen maken om deze, - naast de veel gebruikte gg-muizen 
en gg-ratten  -, als modelsysteem voor onderzoek naar humane ziekten e.d. te gebruiken. Of het 
gewenst is dat gg-apen als ziektemodelsysteem opgang gaan vinden, is de vraag. Er zijn grote 
ethische bezwaren in de maatschappij tegen onderzoek met apen. 
 
Met de ontwikkeling van een systeem om primaten gericht genetisch te modificeren, vervallen veel 
van de praktische bezwaren tegen genetische modificatie van de mens. Vanuit uit wetenschappelijk 
oogpunt is de stap van aap naar mens klein. Vanuit de wetenschap en patiënten(organisaties) zal de 
vraag ontstaan waarom kiembaan-gentherapie in bepaalde gevallen niet toegestaan  is. Wegen de 
ethische bezwaren over verandering en mogelijke  ‘enhancement’ van de mens op tegen de 
mogelijkheid om erfelijke ziekten uit te bannen en de kinderwens van dragers van erfelijke ziekten 
mogelijk te maken? 
 
Een vergelijkbare discussie speelt al over de zogenaamde drie-ouder kinderen bij mitochondriale 
ziektes. Mitochondriale ziektes overerven via de moederlijn. Door bij een IVF bevruchting een 
celkerntransplantatie uit te voeren naar een eicel van een gezonde donor die vervolgens bevrucht 
wordt met het sperma van de vader, wordt de ziekte uitgebannen. De Engelse Nuffield Council on 
Bioethics  is van mening dat dit ethisch acceptabel is.85  Begin 2014 heeft de Engelse regering 
conceptrichtlijnen gepubliceerd die celkerntransplantatie mogelijk moeten maken. 
 
 
7. Conclusies 
•  CRISPR-Cas is een nieuwe techniek voor gene  of  genome editing  die ongekend snel 
geadopteerd is binnen het wetenschapsveld van de biotechnologie. Genome editing  wordt 
hiermee een standaardtechniek voor elk onderzoekslaboratorium binnen de levens-
wetenschappen; 
•  De technologie is nog nieuw en in de toekomst zullen nog niet voorziene toepassingen 
ontwikkeld worden; 
 
•  Binnen het huidige EU juridische kader lijken toepassingen van CRISPR-Cas onder de ggo-
regelgeving te vallen; 
•  CRISPR-Cas kan echter voor diverse doeleinden ingezet worden, waarbij een aantal van de 
toepassingen voor vrijstelling in aanmerking zou moeten komen; 
 
•  Nieuwe technieken als CRISPR-Cas tonen aan dat de huidige EU regelgeving over ggo’s aan 
herziening toe is; 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
16 
 

•  De COGEM signaleert dat de Nederlandse overheid en de Europese Commissie zich gezien de 
wetenschappelijke en technische ontwikkelingen moeten bezinnen op herziening of aanpassing 
van de EU ggo-regelgeving; 
 
•  Een besluit of toepassingen en producten van CRISPR-Cas al dan niet onder de ggo-
regelgeving vallen, kan grote gevolgen hebben voor de innovatie binnen de EU en de 
economische positie van het Europese bedrijfsleven; 
•  Gezien het grote belang van deze techniek voor zowel bedrijfsleven als de maatschappij 
(medische toepassingen, etc.) adviseert de COGEM dat de Nederlandse overheid zich sterk 
maakt voor een snel besluit over de juridische status van deze techniek en haar toepassingen en 
producten in de EU;  
 
•  De toegenomen technische mogelijkheden om gerichte aanpassingen in het genoom van plant, 
dier en mens aan te brengen, zullen ook ethische vragen oproepen, zoals waarom het niet 
toegestaan is om via genetische modificatie erfelijke ziektes bij de mens uit te bannen; 
 
 
 
 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
17 
 

Referenties 
 
1.   Hsu PD et al (2014). Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 157: 
1262-1278 
2. 
Gaj T et al. (2013). ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends 
Biotechnol. 31: 397-405 
3. 
Bibikova M et al. (2002). Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-
finger nucleases. Genetics 161: 1169-1175 
4. 
Urnov RD et al. (2005). Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger 
nucleases. Nature 435: 646-651 
5. 
COGEM (2009). Zinkvinger aan de pols; ontwikkelingen en implicaties van de zinkvingertechnologie. 
COGEM signalering CGM/090616-02 
6. 
Christian M et al. (2010). Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 
186: 757-761 
7. 
Cermak T et al. (2011). Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based 
constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39: e82 
8. 
Wood AJ et al. (2011). Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science 333: 
30 
9. 
Mussolino C et al. (2011). A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in 
combination with low toxicity. Nucleic Acids Res. 39: 9283–9293 
10.  Zhang F et al. (2011). Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating 
mammalian transcription. Nat. Biotechnol. 29: 149–153 
11.  Ye L et al. (2014). Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural 
CCR5Δ32 mutation confers resistance to HIV infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111: 9591-9596 
12.  Jiang W et al. (2014). Efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana and 
inheritance of modified genes in the T2 and T3 generations. PLoS One. 9: e99225 
13.  Wang Y et al. (2014). Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers 
heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. doi: 10.1038/nbt.2969. [Epub ahead of print] 
14.  Schwank G et al. (2013). Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids 
of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13: 653-658 
15.  Maeder ML et al. (2013). CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat. Methods 
10: 977–979  
16.  Sorek R et al. (2008). CRISPR - a widespread system that provides acquired resistance against phages 
in bacteria and archaea. Nat. Rev. Microbiol. 6: 181-186 
17.  van der Oost J et al. (2009). CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends 
Biochem. Sci. 34: 401 
18.  Jinek M et al. (2012). A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial 
immunity. Science 337: 816 
19.  Cong L et al. (2013). Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339: 819–823  
20.  Wyman C & Kanaar R (2006). DNA double-strand break repair: all’s well that ends well. Annu. Rev. 
Genet. 40: 363–383 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
18 
 

 
21.  Hwang WY et al. (2013). Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat. 
Biotechnol. 31: 227-229 
22.  Wu Y et al. (2013). Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 
13: 659-662 
23.  Mali P et al. (2013). RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339: 823–826 
24.  Feng Z et al. (2013). Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res. 23: 
1229-1232 
25.   Baltes NJ et al. (2014). DNA replicons for plant genomic engineering. The Plant Cell 26: 151-163 
26.  Jinek M et al. (2013). RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471  
27.  Niu Y et al. (2014). Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene 
targeting in one-cell embryos. Cell 156: 836-834 
28.  Ran FA et al. (2013). Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing 
specificity. Cell 154: 1380–1389 
29.  Mali P et al. (2013). CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases 
for cooperative genome engineering. Nat. Biotechnol. 31: 833–838 
30.   Cho SW et al. (2014). Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided 
endonucleases and nickases. Genome Res. 24: 132-141 
31.  Qi LS et al. (2013). Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of 
gene expression. Cell 152: 1173–1183 
32.  Maeder ML et al. (2013). CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat. Methods 
10: 977–979  
33.  Perez-Pinera P et al. (2013). RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. 
Nat. Methods 10: 973–976 
34.  Cheng AW et al. (2013). Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided 
transcriptional activator system. Cell Res. 23: 1163–1171 
35.  Gilbert LA et al. (2013). CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in 
eukaryotes. Cell 154: 442–451  
36.  Tsai SQ et al. (2014). Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. 
Nat. Biotechnol. 32: 569-576 
37.   O’Conell MR et al (2014). Programmable RNA recognition and cleavage by CRISPR/Cas9. Nature. 
Doi: 10.1038/nature 13769 [Epub ahead of print] 
38.   Gersbach C (2014). Genome engineering: the next genomic revolution. Nature Methods 11: 1009-1011  
39.  Cho SW et al. (2013). Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided 
endonuclease. Nat. Biotechnol. 31: 230–232 
40.  Mali P et al. (2013). Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat. Methods 10: 957–963 
41.  Wang H et al. (2013). One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by 
CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153: 910–918 
42.  Gratz SJ et al. (2013). Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 
nuclease. Genetics 194: 1029-1035 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
19 
 

 
43.  Li D et al. (2013). Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat. 
Biotechnol. 31: 681–683 
44.  Li W et al. (2013). Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat 
using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. 31: 684–686 
45.  Ma Y et al. (2014). Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24: 122–125 
46.  Shen H. (2013). Precision gene editing paves way for transgenic monkeys. Nature 503: 14–15 
47.  Yang D et al. (2014). Effective gene targeting in rabbits using RNA-guided Cas9 nucleases. J. Mol. Cell 
Biol. 6: 97–99  
48.  Li JF et al. (2013). Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis 
and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat. Biotechnol. 31: 688–691 
49.  Nekrasov V et al. (2013). Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 
RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. 31: 691–693  
50.  Shan Q et al. (2013). Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. 
Biotechnol. 31: 686–688 
51.  Jiang W et al. (2013). Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in 
Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res. 41, e188 
52.  Wang H et al. (2013). One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by 
CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 153(4): 910–918 
53.  Tan W et al. (2013). Efficient nonmeiotic allele introgression in livestock using custom endonucleases. 
Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110: 16526-16531 
54.   Xue W et al (2014). CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver. Nature 514: 
380-384  
55.  Yin H et al. (2014). Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. 
Nat. Biotechnol. 32: 551-553 
56.  Xie F et al. (2014). Seamless gene correction of β-thalassemia mutations in patient-specific iPSCs using 
CRISPR/Cas9 and piggyback. Genome Res. 2014 Aug 5. pii: gr.173427.114. [Epub ahead of print] 
57.   Kennedy EM et al. (2014). Inactivation of the Human Papillomavirus E6 or E7 gene in cervical 
carcinoma cells by using a bacterial CRISPR/Cas RNA-guided endonuclease. J. Virol. 88 (20): 11965-
11972 
58.   Citorik RJ et al. (2014). Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided 
nucleases. Nat. Biotechnol. Doi:10.1038/nbt.3011  
59.   Holkens M et al (2014). Adenoviral vector DNA for accurate genome editing with engineerd nucleases. 
Nature Methods 11: 1051-1057 
60.  Jiang W et al. (2014). Efficient CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana and 
inheritance of modified genes in the T2 and T3 generations. PLoS One 9: e99225  
61.   Brooks C et al. (2014).Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR/Cas9 
system. Pl ant Physiol. doi: http://dx.doi.org/10.1104/pp.114.247577 [Epub ahead of print] 
62.  Wang Y et al. (2014). Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers 
heritable resistance to powdery mildew. Nat. Biotechnol. 2014 Jul 20. doi: 10.1038/nbt.2969. [Epub 
ahead of print] 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
20 
 

 
63.   Marx V (2014). Gene editing: how to stay on-target with CRISPR. Nature Methodology 11: 1021-1025 
64.  Fu Y et al. (2013). High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human 
cells. Nat. Biotechnol. 31: 822-826 
65.  Hsu PD et al. (2013). DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31: 
827-832 
66.  Pattanayak V et al. (2013). High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-
programmed Cas9 nuclease specificity. Nat. Biotechnol. 31: 839-843 
67.  Xie S et al. (2014). sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating 
potential off-target cleavage sites. PLoS One 9: e100448 
68.  Montague TG et al. (2014). CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. 
Nucleic Acids Res. 42 (Web Server issue): W401-7 
69.   Zhu LJ et al. (2014). CRIPRSeek: a bioconductor package to identify target-specific guide RNAs for 
CRISPR-Cas9 genome editing systems. Plos One 9: e108424 
70.  Fu Y et al. (2014). Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. 
Biotechnol. 32: 279-284 
71.   Eisenstein M (2014). Hitting the mark. Nature Methods 11: 894 
72.   Smith C et al. (2014). Whole-genome sequencing analysis reveals high specificity of CRISPR/Cas9 and 
TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell 15: 12–13 
73.   Suzuki K et al. (2014). Targeted gene correction minimally impacts whole-genome mutational load in 
human-disease-specific induced pluripotent stem cell clones. Cell Stem Cell 15: 31–36 
74.   Veres A et al. (2014). Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN 
targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell 15: 27–30 
75.  COGEM (2006). Nieuwe technieken in de plantenbiotechnologie. COGEM signalering CGM/061024-
02 
76.  COGEM (2010). De status van oligonucleotiden in de context van gerichte mutagenese. COGEM 
signalering CGM/100701-03 
77.   COGEM (2009). EU-regelgeving updaten? Wetenschappelijke ontwikkelingen werpen nieuw licht op 
de proces- en productbenadering. COGEM signalering CGM/090626-03 
78.   COGEM (2013). Synthetische Biologie - update 2013. COGEM signalering CGM/130117-01 
79.  Rusk N (2014). CRISPR circuits. Nature Methods 11: 710–711 
80.   Kiani et al (2014). CRISPR transcriptional repression devices and layered circuits in mammalian cells. 
Nature Methods 11: 723–726 
81.   Granahan P & Loughran CA (2014). CRISPR/Cas-9: An exciting addition to genomic editing. Life 
Sciences Law & Industry Report, March 2014. 
www.wolfgreenfield.com/files/granahan_and_loughran__crispr_cas9_.pdf 
82.   Fong T (2014). As CRISPR-Cas9 technology sets to take off, uncertainty swirls around IP landscape. 
Genome Web Daily News. June 18, 2014. www.genomeweb.com/rnai/crispr-cas9-technology-sets-take-
uncertainty-swirls-around-ip-landscape 
83.   Sheridan C (2014). First CRISPR-Cas patent opens race to stake out intellectual property. Nat. 
Biotechnol. 32: 599-601 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
21 
 

 
84.   Patent application WO 2014144155 A1 (2014) Engineering plant genomes using CRISPR/Cas systems. 
(Filing date 18 Sept 2014; Regents of the University of Minesota, applicant)  
85.   Nuffield Council on Bioethics (2012). Novel techniques for the prevention of mitochondrial DNA 
disorders: an ethical review. http://nuffieldbioethics.org/project/mitochondrial-dna-
disorders/#sthash.gWy0PFsP.dpuf 
COGEM signalering en advies CGM/141030-01 
22 
 

Document Outline