Document 15
Kontaktai: +37069400210, xxxx@xxxxxxx.xxx
Vilnius, 2019
Turinys:
1.
............................................................................................................................. 3
2.
............................................................................... 5
3.
.............................................. 8
......................................................................... 8
3.2 Genomo DNR sekos modifikavimas ..................................................................................... 9
3.3 Epigenetiniai metodai .......................................................................................................... 14
3.4 Kiti metodai ......................................................................................................................... 15
4.
............................................. 17
.................................................................................................... 18
......................................................................................... 19
5.
............................................................................. 21
5.1 Derlingumo padidinimas ..................................................................................................... 22
5.2 Atsparumas ligoms .............................................................................................................. 22
5.3 Prisitaikymas prie aplinkos ................................................................................................. 23
5.4 Atsparumas herbicidams ..................................................................................................... 23
.............................................................................................. 24
5.6 Galimas NGMM pritaikymas Lietuvoje ............................................................................. 25
6. NGMM Lietuvoje ir pasaulyje .............................................................................................. 26
7.
...................................................................... 27
8.
..................................................................................................... 28
9.
................................................................................................................. 30
2
1.
, medicinoje ir kitose srityse yra
dirbamos
s
kad norit patenkinti
us
produkcijos apimtys tarp
s
(1).
praturtinto naudingomis mityb
Tam, kad
problemos
,
pvz.,
l
o
poreikius bei
tam, kad
me
,
gen
modifikacijos metod
toliau -
NGMM) suteikiamus privalumus, sukuriant
tar
visame pasaulyje kyla
papildom
reguliuoja
(2).
Europos S
(toliau ES)
organizmus (toliau -
metais. Nuo tada GMO
reguliuojantys
buvo taisomi,
nekito, nors
buvo pademonstruota, kad mutacijos organizmo DNR atsiranda ir
(3).
GMO re
remiasi Europos Parlamento ir Tarybos direktyva
2001/18/EB
- 2001/18/EB direktyva). Per pastaruosius metus buvo
/18/EB direktyv kyla daug
, NGMM
yra
tradiciniais
metodais. ES
ir
supaprastinta tvarka (4). Kinija ir Rusija investuoja
did
(5, 6). Tuo tarpu ES atveju, po 2018 m
liepos 25 d. ES
teisingumo teismo sprendimo, visi modifikuoti organizmai,
gautus
mutagenez
bus laikomi GMO (7).
ioje
aptariami biotechnologiniai metodai, priskirtini prie NGMM, tokie kaip genomo
3
as
,
suteiktos augalams panaudojant NGMM.
NGMM panaudojimo atvejai Lietuvoje ir Europoje bei reglamentavimo ypatumai
kitose pasaulio
ikiamos rekomendacijos NGMM reguliacijai Lietuvoje.
4
2.
Agroinfiltracija (angl. agroinfiltration) metodas,
), pristatyti transgenus siekiant pagaminti
(8).
) (angl. random mutagenesis, traditional
mutagenesis) -
, kai mutacijos
org
mutagenais, o po to atrenkami individai su
pageidaujamomis
mis
,
arba cheminiai (pvz. alkilinimo agentai) (9).
(angl. base editing) -
,
nti tikslingai
(10).
Cas9 (angl. CRISPR associated protein 9) - d
tikslinei mutagenezei
pa
, programuojama RNR pagalba (14, 15).
(angl. zinc finger nucleases, ZFN)
(8).
(angl. cisgenesis) -
,
organizme (3).
CRISPR/Cas (angl. clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR
associated)
apsaugos mechanizmas lemian
CRISPR/Cas sistemas sudaro CRISPR regionas,
-
i Cas genai (11).
Egzogeninis genas (angl. exogenous) genas
(9).
5
(GMO)
.
(angl. gene editing) -
genomus (9).
Insercija arba delecija (angl. insertion, deletion)
(9).
(angl. intragenesis) tai
DNR kombinacija (bet kuria orientacija),
(3).
(angl. mutagenesis) procesas,
DNR seka
(9).
(NGMM, angl. new plant breeding techniques,
new mutagenesis techniques) -
metodai, sukurti po Europos Parlamento ir Tarybos 2001/18/EB direktyvos
(1 3, 7, 9).
Nuo RNR priklausomas DNR metilinimas (angl. RNA-directed DNA methylation,
RdDM) - indukuojamas DNR c
metilinimas,
veikti
nt dirbtinius
us,
(27, 28).
Tiks
SDN-1 (angl. site directed nucleases 1)
specifi
parinktoje genomo vietoje (2).
SDN-2 (angl. site directed nucleases 2) -
specifi
(2).
6
-3 (angl. site directed nucleases 3)
specifi
(2).
Oligonukleotidai (angl. oligonucleotides)
(8).
Oligonukleotidais indukuota
(angl. oligonucleotide-directed mutagenesis,
ODM) -
a
,
(8).
(angl. off-target mutations) neplanuotos mutacijos tikslios
stos kitoje vietoje nei numatytas taikinys. Jos
(9).
TALE
(angl. transcription activator-like effector nucleases, TALEN)
(8).
(angl. point mutation) mutacija lemianti tik vienos
(9).
(angl. directed mutagenesis, site-
specific mutagenesis) -
i fermentai -
(9).
(angl. transgenesis)
(9).
7
3.
K
komi NGMM
3.1
NGMM yra laikomi biotechnologijomis
pvz.,
metodai), kurie buvo sukurti po Europos Parlamento ir Tarybos direktyvos
panaikinanti
20/EEB
(1 3, 7, 9). NGMM
modifikacij
pakeista. Tai
institucijoms.
labai
platus ir
Kai kurie metodai, tokie
, yra
,
bei
kiti metodai yra seniai naudojami (pvz., skiepijimas), tiesiog jie pritaikyti panaudojant naujausias
,
avimo
transgenus, neperduodamus palikuoniams.
a)
:
- Tiksli
taikiniui specifines nukleazes (angl. site directed
mutagenesis, SDM);
-
;
- Tiksli
t trumpus viengrand
oligonukleotidus (angl. oligo
directed mutagenesis, ODM);
8
-
intra
.
b) Epigenetiniai metodai:
-
(RdDM)
c) Kiti metodai:
- Agroinfiltracija;
- Skiepijimas (nemodifikuoto daigo
);
- Negatyvi selekcija (m
).
3.2 Genomo DNR sekos modifikavimas
o
apima metodus, kurie
tikslioje vietoje modifikuoti
genom
DNR
.
i tikslingai keisti naudojamas metodas remiasi
taikiniui specifin
nukleaz
(angl. site directed nucleases, toliau SDN)
(ZFN)
-
. D
vadinama Cas9 yra programuojama RNR pagalba (14, 15). Cas9
su ja
ir viena
atitinkama seka,
tuo tarpu kita
-kilpa. Cas9
baltymas turi du atskirus aktyviuosius centrus, kurie perkerpa
su
RNR DNR grandin tikslioje vietoje (1A paveikslas). Tokiu b
Cas9 galima gan greitai
tereikia pakeisti
gRNR sek
taikinio seka yra pakankamai ilga, kad visoje
genomin
DNR
gaunamas mutantinis fermentas (dCas9),
DNR, bet jos nekirpti (1B paveikslas
9
pvz., DNR c
adenino
prie
genom
DNR sekos (10, 16).
1 paveikslas. Cas9 baltymo DNR kirpimo mechanizmas. A. Cas9 baltymas - RNR
B.
gaunamas baltymas dCas9,
(adaptuota
pagal (17) ).
zinc finger nucleases, toliau ZFN) ir transkripcijos efektorius
transcription activator like effector nucleases, toliau TALEN)
rie kurio yra prilietas FokI restrikcijos
nukleazinis
domenas (18)
1996 m. (19)
,
,
o
b
(20)
,
beveik visas
(20)
tokio
omeno dimerizacija.
To
ZFN, nukreipt gretimus taiki
m, kad endonukl
(20).
Nepaisant pasitvirtinusio molekulinio mechanizmo, ZFN
,
efektyv
kerpa
es sekas ir tai sunku prognozuoti (17).
10
Xanthomonas bakterijose buvo rastas dar vienas
modulinis DNR at
, pavadintas transkripcijos aktyvatorius primenan
efektoriumi (angl. transcription activator like effector, toliau TALE) (21, 22). Infekcijos metu
faktorius jungiasi prie
-
. Galima tik 12 ir 13
am
ies variacija jos
u
. Kaip ir ZFN
atveju,
leaziniu domenu gautas veiksmingas fermentas
TALE
(23, 24) .
Lyginant su ZF
os savait s) bei lengviau
prognozuojamas, t
ir prigimties visi TALE motyv
ios tarpusavyje (17).
Tiksli
pa
DNR
genomo vietoje (2 paveikslas)
- nehomologinio
o (toliau NHEJ) arba
s rekombinacijos (toliau HR) pagalba. NHEJ mechanizm
, kai
hanizmo pagalba, kirpimo vietoje atsiranda
delecij ar insercij . Tokia mutagenez
, kuomet kontroliuojama mutacijos vieta, bet ne
tipas, vadinama SDN-1 technologija.
kelias
pasitelkiamas,
Homolog
-
DNR
kuriam
reikalinga matrica, atitinkanti
.
su
trumpa DNR matrica,
pokyt
Modifikacija
ma
, o jos
os DNR
matricos seka.
yra lengva prognozuoti modifikacijos rezultatus ir tokia technologija
vadinama SDN-2 (2 paveikslas).
o
masto
,
tai vadinama SDN-3 technologija. Tuomet
a
11
modifikuojamo genomo sekoms
technologija, kitaip nei tradiciniai
gavimo
nauj sek
yti
2 paveikslas).
bei
(8).
2 paveikslas. Tiksli
kleazes (pvz., Cas9).
Taikiniui
am
pasirinktoje genomo
DNR vietoje. Priklausomai nuo to, kokiu keliu vyksta
-1
-
(SDN-3 technologija).
Naujausia taikiniui
angl. base editing),
ntis
(16, 25).
s laikomas saugesne alternatyva, nes
e toksinio poveikio
e.
e
paremta
, kurios modifikuoja
citozino arba adenino bazes
-
amino funkcines grupes. Taip citozinas
uracilu, kuris DNR replikacijos metu
skaitomas kaip timinas.
adenino gaunamas inozinas kuris vykstant replikacijai yra
skaitomas kaip g
citozino-guanino poros pakeitimas
timino-a
adenino-timino poros guanino-citozino.
suliejus su
12
(dCas9) (1B paveikslas)
tiksliai nukreip
DNR
modifikuoti. dCas9 jungiasi prie DNR sudarydamas R-
gidu
n
lieka neapsaugota d
,
sulietos su dCas9 (16, 25).
i pritaikytas
daug
vienu metu (26).
. oligo directed mutagenesis
arba chimeriniai fragmentai
augalo genome. Tik vienas ar keli nukleotidai, esantys oligonukleotido centre, nesutampa su
pirmine DNR seka
s
a
s
(8).
os atskirai,
organizmo DNR, su kuriuo
perdavimas
.
kokiu metodu
DNR.
- tai organizmo
, kuriai panaudotas genas
, su
.
a
(promotoriai, terminatori
(3). Tuo tarpu
skiriasi tuo, kad yra
kokia orientacija, kurios
taip pat
(3).
Visi metodai, skirti genomo sekai modifikuoti,
tradicinei transgenezei, p
taikiniui specifines
nukleazes galima
3 paveikslas).
13
3
skirtumai.
SDN-
a yra
,
N-2,
-
pagal (2)).
3.3 Epigenetiniai metodai
Epigenetiniai metodai, tokie kaip nuo RNR priklausomas DNR metilinimas arba nuo RNR
,
dinti ar
reguliacijai ir yra paveldimas bent keliose kartose. DNR metilinimas taip pat
chrom
- modifikacijomis. Yra pademonstruota, kad DNR
metilinimas lemia ir lokalias
-
paveikti
nt keliose
kartose, net kai
veiksnio ,
.
norimoje vietoje galima sukelti panaudojant neseniai (1B paveikslas) sukurtus molekulinius
iuose prie dCas9 baltymo yra prijungtas DNR metilinimo arba histonus
14
modifikuojantis domenas (27, 28)
kaip baltymo-RNR kompleksas.
augalo dalis
taip pat
(2).
pats seniausias metodas
u
u (angl. virus-induced gene silencing, VIGS)
is metodas veikia per augaluose
RNR interferencijos
Jis remiasi tuo, jog
seka,
prasminis nepageidaujamo geno informacinei
rios
a
(12, 13)
3.4 Kiti metodai
su biotechnologijomis. Agro-infiltracija
, lapus) pristatyti transgenus siekiant pa
tampa vienu
indukuoti, gaminant biologines
(29). Agro-infiltracijai naudojamos Agrobacterium sp. bakterijos, DNR plazmidiniame
vektoriuje ko
Agrobacterium sp. bakterijomis
suleista atskiras augalo dalis, arba pristatyta panaudojant
.
anaudojami
, nuskinti lapai) arba
Jei
agrobakterij
lokalizuotoje augalo dalyje.
ansgenas
o DNR
bei
. Tokiu atveju,
s ir palikuoniams
(8).
Skiepijimas
augalo
(poskiepio). Jei
e
15
pav
(8).
reikalingas transgeno
s
selekcijos pagalba.
, galima
,
nuo RNR priklausomo DNR metilinimo pagalba.
naudojant
(8).
16
4.
G
naudojant NGMM
tos
kelios NGMM mokslin
, kurie vertino ir galimas rizikas (1 3, 9, 30). Vertinant rizik
modifikacijos keliamus
atsitikimo
Pagal 2001/18/EB
(priedas II) ir r
B) Nr. 1829/2003, bet kurios potencialiai
,
yra panaudojama sudaryti rizikos hipotezes,
tolimesniuose etapuose.
,
, rizika vertinama lyginant
saugus vartojimas patvirtintas ilgalaikiai
Poveikio
aplinkai rizikos vertinimas yra rekomenduojamas, bet kadangi negalima
saugaus
naudojimo istorij ,
vertinamas rizikos dydis
. Kitaip tariant,
mod
, o vertinama
labiau
u
iuos kriterijus labai sunku vertinti
(2).
aus sveikatai
kurias
sveikatai lemia GMO auginimas, bet ne kiti
to kylantys padariniai.
alergines
(30). Tuo
valdymas. G
naujos savyb s gali atsiras
-
,
Vertinant NGMM
savybes,
: i) m
(kai naudojamas); ii) faktas, kad modifikacija yra pasirenkama tikslingai; iii) keletas
ama vienu metu.
17
Bendrai NGMM rizik
grupes
1):
1.
n
geno likimas
;
2.
rizikos susijusios su tuo, kad NGMM lems
;
3.
r
1 l
Rizikos veiksnys
Socioekonominiai veiksniai
Monopolizacija
Poveikis aplinkinei biologinei
individualiai
4.1
NGMM efektai
M gali
. Pirmiausia,
naudojami genomui
Metodai,
kurie naudoja baltymus kaip -
iki 5 n
(15,
31, 32)
genomas perkerpama
o su dvejomis
, tai gali
(33, 34).
iai
ir kitoms tikslioms nukle
N) (35, 36),
, kurie remiasi Cas9
18
baltymu su
(pvz.
o technologija) (37, 38). Reikia
,
(2). M
, tokie kaip Cas9,
yra intensyviai tobulinami ir tampa vis saugesni (39 41). Be to, yra
,
,
ntys kontroliuoti
, tokie kaip tiesioginis baltymo-
RNR komplekso pristatymas
tiksl
(42).
Dauguma NGMM
baltymo-
RNR
koduojanti DNR ar RNR
. Norint i
rekomenduojama patikrinti,
, tai yra ar organizmas netapo transgeniniu (2).
agroinfiltracija ar skiepijimas ant GMO
. Agroinfiltracijos atveju
augalo
O
- kad transgenas bus perduotas
nemodifikuotai augalo daliai bei palikuoniams (8).
4.2
Nors greitesnis
procesas yra svarbus
savybes
odai
skirtingus genus vienu metu (angl. multiplexing) (43).
t
.
19
vedimo greitis
ir maisto apdorojimo
int
Daug didesnis NGMM efektyvumas gali lemti
potencialiai
omis savyb
, o taip pat ir
, kad tai
,
prireiks laiko prisitaikyti.
srities
ir konkuruoti.
aplinkinei biologinei
(2).
monopolizuota (
as ir did
), kaip ai
(44).
ir tai gali padaryti tik
(30).
4.3
Gali kilti r
veislei,
Naujai
suteiktos
padaryti augalus atspariu
(45, 46). Reikia
- tiek
,
.
,
kaip atsparumas druskingumui, sausrai
plotus (2).
20
5.
K
Pagrindinis NGMM panaudojimo tikslas yra
suteikti naujas
naudingas savybes,
a gauti tradicin
bent
(4 paveikslas).
4 paveikslas. NGMM
(adaptuota pagal (46))
(45 47) (4 paveikslas). Be
genus bei sekos
variantus bei modifikaci
(46).
21
5.1 Derlingumo padidinimas
derlingumas. Derlingumas
quantitative trait loci
(48, 49)
tarpu N
derlingumo padidinimo
kelias pasitelkiant tiksli
-
2 paveikslas)
(46, 50, 51). Taip
Oriza sativa) buvo gautas
(52).
5.2 Atsparumas ligoms
ogenais: virusais,
(46, 53)
atsparius augalus. Tam buvo pritaikytos bent 2
strategijos.
Pirmuoju keliu
(46)
Xanthomonas citri bakterijoms augalams buvo suteiktas Cas9
pagalba modifikavus CsLOB1 geno promotoriaus sek
jo
patenka
b
, kuris jungiasi prie CsLOB1 geno promotoriaus,
augalo promotoriaus
(54)
Xanthomonas
rice blight). Bakterija
22
patogeno poreikius. Jau 2012 m. mokslininkai modifikavo
,
(55), o 2019 m.
buvo sukurti
Xanthomonas oryzae
kamienams
(56).
,
dauginimuisi. Atsparumas gryb
angl. powdery mildew) buvo
3 augalo genus: TAMLO-A, TAMLO-B ir TAMLO-D (56)
omidorai -
(57).
5.3 Prisitaikymas prie aplinkos
, tokie
,
(47). Kintantis
Augalai, kurie
prisitaikymo mechanizmus, gali geriau pakelti nepalankias
a, t
as vaidmuo tenka
transkripcijos reguliacijos veiksniams (58)
, kurie genai
svarba
panaudojant tradicinius
(59). Arabidobsis augalo atsparumas
sausrai buvo padidintas
kuri
(60)
,
bet
(61).
5.4 Atsparumas herbicidams
ku
vietos bei
herbicidai
arbius
, bet gali
iniams augalams
, nes pakelia
gaus sveikatai, neigiamai veikti
23
bio
(46).
herbicidams atsparius augalus buvo
panaudojama
,
, kurie skaido herbicidus. Ten,
,
ir neigiami
naudojimo padariniai (62).
, kuris dalyvauja svarbiame metaboliniame
, chemikalai (imidazolinonai, sulfonilkarbamidai
ktato
,
edagavimo metodus (ODM, TALEN ar Cas9)
buvo
(bulv
, sojos,
ALS aktyvusis centras ir gautos
,
(62)
a leido gauti ir glikofosfatui atsparius
linus
us (63, 64)
,
5-
-3-fosfato
kuri dalyvauja
pirmtako
- potencialus kancerogenas, kuris
i
kurias kepant nesusidaro akrilamidas (65)
itim , taip pat
likopeno kiekius (46).
Au
,
vienos
:
s (
) arba
os (amilopektinas). Augalai, kurie sintetina
,
24
a
,
,
yra sunku pa
oms
sukurti
-1 technologijos
,
dalyvaujantis krakmolo
(66, 67).
Cas9 technologija buvo panaudota ir siekiant
norint
pagerinti tiek maistines savybes, tiek biokuro
ose
,
oksidacinio stabilumo. Pa
angl. fatty acid desaturases, FAD).
i
-A1 ir FAD2-
go
net 4 kartus (46, 59).
5.6 Galimas NGMM pritaikymas Lietuvoje
, esant tokiai galimybei, jos
potencialo didinti
derlingum ir
atsparum
taip pat
bei
as remiasi atsparumo ligoms didinimu
usios
Italijoje pavyzdys (68)
buvo sunaikinta apie ketvirtadalis
(69)
,
atsparumu ligoms,
nuostolius.
Ir galiausiai,
,
vartoti maistingesnius ir naudingesnius maisto produktus.
25
6.
NGMM Lietuvoje ir pasaulyje
www.gmo.am.lt). Tai patvirtina
Ta
S
us.
(70).
panaudojimu bei poveikio aplinkai vertinimu vykdomi Vokietijoje (4).
,
taip pat
2017-2019
analizes apie
aplinkai
.
-
nekelia
papildom
Ta
panaudojant
sukurtus organizmus
pagal naujas
jiems gauti (2, 30).
ES
(5, 6, 71).
,
JAV
tarnyba (angl. Food and Drug Administration, FDA)
, kad panaudojant NGMM
, kol mutacijos yra tokios pat,
(71, 72)
reguliacijos, tai yra, bus
,
, kokias naujas savybes ji turi. Poveikis
sveikatai ir aplinkai bus vertinamas tik tada, jei atsiranda naujos
, nepriklausomai ar augalo
,
(73). Australija pasirinko kiek
g
nei JAV
tik tokiu atveju, jei NGMM
seka (74).
manoma,
investuoja labai dideles
mui
(5).
Rusijoje pradedama 1.7
30
panaudojant gen redagavim (6).
, ES ateityje gali tapti
jos gyventojai praras galimyb
aplinkoje ir
26
7.
reglamentavimas Lietuvoje
Parlamento ir Tarybos direktyva 2001/18/EB
tradiciniams
kurie yra paremti naujausiais b
nebuvo sutarta kaip reguliuoti NGM
liepos 25 d. Europos teisingumo teismas
visi organizmai, sukurti panaudojant
ojami kaip GMO ir reguliuojami 2001/18/BE direktyvos.
taikoma tik tradiciniams
tik
Tuo tarpu
ar metodai, kuriose naudojamas transgenas neperduodamas palikuoniams, reguliavimo
27
8.
Nors 2018 m. Liepos 25 d. Europos teisingumo teismo priimtas sprendimas GMO
, jis ne sprend
, su kuriais susiduria
ES ir visa
populiacija
,
NGMM
tai
reikalingomis
DNR modifikacijas, kurios yra
gaunamoms
ais. Be to,
moksliniai tyrimai rodo,
tikslesni
transgenez , o daugeliu atveju net
mutagenez
, jei
K
tiek
,
)
NGMM metodu gaut
l
.
yra Kanados sprendimas organizmus reguliuoti ir kontroliuoti ne pagal tai kokiu
jie
. Juk n
sveikatai ir
aplinkai sukelti gali ne pati DNR modifikacija, bet nauj
organizmo
Be to t
nereguliavimas
,
, kad buvo panaudotos
redagavimo technologijos.
reguliavimas.
GMO
, naudojamas 2001/18/EB direktyvoje, buvo priimtas 1990 m. ir yra
iuo metu jau yra
,
ir
2001/18/EB direktyvoje
priskiriamos. Be to,
iai
proceso DNR reparacijos
28
S
tam,
naujausiais moksliniais
.
optimalus sprendimas b
s, moksl
, verslo, politik ) diskusija sprendimui priimti.
atsakingoms
,
kad tokios di
.
29
9.
1. Joint Research Renter (2011) New plant breeding techniques. State-of-the-art and prospects
for commercial development.
http://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/handle/JRC63971
2. High Council for Biotechnology (HCB) (2017) An opinion on NPBTs.
http://www.hautconseildesbiotechnologies.fr/fr/avis/avis-sur-nouvelles-techniques-
dobtention-plantes-new-plant-breeding-techniques-npbt
3. EFSA Panel,G.M.E.P. (2012) Scientific opinion addressing the safety assessment of plants
developed through cisgenesis and intragenesis. EFSA J., 10, 2561.
4. Eckerstorfer,M.F., Engelhard,M., Heissenberger,A., Simon,S. and Teichmann,H. (2019)
Plants Developed by New Genetic Modification Techniques Comparison of Existing
Regulatory Frameworks in the EU and Non-EU Countries. Front. Bioeng. Biotechnol., 7.
5. Cohen,J. (2019) To feed its 1.4 billion, China bets big on genome editing of crops. Science,
10.1126/science.aay8951.
6. Dobrovidova,O. (2019) Russia joins in global gene-editing bonanza. Nature, 569, 319 320.
7. Laaninen,T. (2019) New plant-breeding techniques: Applicability of EU GMO rules.
https://www.europarl.europa.eu/thinktank/en/document.html?reference=EPRS_BRI(2019)6
42235
8. Lusser,M. and Davies,H. V. (2013) Comparative regulatory approaches for groups of new
plant breeding techniques. N. Biotechnol., 30, 437 446.
9. SAM (2018) Scientific Perspective on the Regulatory Status of Products Derived from Gene
Editing and the Implications for the GMO Directive. 10.2777/407732.
10. Komor,A.C., Kim,Y.B., Packer,M.S., Zuris,J.A. and Liu,D.R. (2016) Programmable editing
of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533,
420 424.
11. Barrangou,R., Fremaux,C., Deveau,H., Richards,M., Boyaval,P., Moineau,S., Romero,D.A.
and Horvath,P. (2007) CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in
Prokaryotes. Science, 315, 1709 1712.
12. Lu,R., Martin-Hernandez,A.M., Peart,J.R., Malcuit,I. and Baulcombe,D.C. (2003) Virus-
induced gene silencing in plants. Methods, 30, 296 303.
13. Unver,T. and Budak,H. (2009) Virus-Induced Gene Silencing, a Post Transcriptional Gene
Silencing Method. Int. J. Plant Genomics, 2009, 1 8.
14. Gasiunas,G., Barrangou,R., Horvath,P. and Siksnys,V. (2012) Cas9-crRNA
ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in
bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 109, E2579-2586.
15. Jinek,M., Chylinski,K., Fonfara,I., Hauer,M., Doudna,J.A. and Charpentier,E. (2012) A
programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.
Science, 337, 816 21.
16. Gaudelli,N.M., Komor,A.C., Rees,H.A., Packer,M.S., Badran,A.H., Bryson,D.I. and
30
cleavage. Nature, 10.1038/nature24644.
17. Gasiunas,G. and Siksnys,V. (2013) RNA-dependent DNA endonuclease Cas9 of the CRISPR
system: Holy Grail of genome editing? Trends Microbiol., 21, 562 7.
18. Bitinaite,J., Wah,D.A., Aggarwal,A.K. and Schildkraut,I. (1998) FokI dimerization is
required for DNA cleavage. Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 10570 10575.
19. Kim,Y.G., Cha,J. and Chandrasegaran,S. (1996) Hybrid restriction enzymes: zinc finger
fusions to Fok I cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci., 93, 1156 1160.
20. Klug,A. and Rhodes,D. (1987) Zinc Fingers: A Novel Protein Fold for Nucleic Acid
Recognition. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 52, 473 482.
21. Moscou,M.J. and Bogdanove,A.J. (2009) A Simple Cipher Governs DNA Recognition by
TAL Effectors. Science, 326, 1501 1501.
22. Boch,J., Scholze,H., Schornack,S., Landgraf,A., Hahn,S., Kay,S., Lahaye,T., Nickstadt,A.
and Bonas,U. (2009) Breaking the Code of DNA Binding Specificity of TAL-Type III
Effectors. Science, 326, 1509 1512.
23. Li,T., Huang,S., Jiang,W.Z., Wright,D., Spalding,M.H., Weeks,D.P. and Yang,B. (2011)
TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-
cleavage domain. Nucleic Acids Res., 39, 359 372.
24. Christian,M., Cermak,T., Doyle,E.L., Schmidt,C., Zhang,F., Hummel,A., Bogdanove,A.J.
and Voytas,D.F. (2010) Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector
Nucleases. Genetics, 186, 757 761.
25. Kim,Y.B., Komor,A.C., Levy,J.M., Packer,M.S., Zhao,K.T. and Liu,D.R. (2017) Increasing
the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine
deaminase fusions. Nat. Biotechnol., 10.1038/nbt.3803.
26. Mishra,R., Joshi,R.K. and Zhao,K. (2019) Base editing in crops: current advances,
limitations and future implications. Plant Biotechnol. J., 10.1111/pbi.13225.
27. Thakore,P.I., Black,J.B., Hilton,I.B. and Gersbach,C.A. (2016) Editing the epigenome:
technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nat. Methods, 13,
127 137.
28. Xie,N., Zhou,Y., Sun,Q. and Tang,B. (2018) Novel Epigenetic Techniques Provided by the
CRISPR/Cas9 System. Stem Cells Int., 2018, 1 12.
29. Norkunas,K., Harding,R., Dale,J. and Dugdale,B. (2018) Improving agroinfiltration-based
transient gene expression in Nicotiana benthamiana. Plant Methods, 14, 71.
30. The Danish Agricultural Agency (2018) New plant breeding techniques is there a risk?
lbst.dk/fileadmin/user_upload/NaturErhverv/Filer/Styrelsen/Moed_os/Orientation_paper_Ri
sc_ENG.pdf
31. Fu,Y., Sander,J.D., Reyon,D., Cascio,V.M. and Joung,J.K. (2014) Improving CRISPR-Cas
nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat. Biotechnol., 10.1038/nbt.2808.
32. Tsai,S.Q., Zheng,Z., Nguyen,N.T., Liebers,M., Topkar,V. V, Thapar,V., Wyvekens,N.,
Khayter,C., Iafrate,A.J., Le,L.P., et al. (2015) GUIDE-seq enables genome-wide profiling
31
of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat. Biotechnol., 33, 187 197.
33. Kosicki,M., Tomberg,K. and Bradley,A. (2018) Repair of double-strand breaks induced by
CRISPR Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nat. Biotechnol., 36,
765 771.
34. Pacher,M., Schmidt-Puchta,W. and Puchta,H. (2007) Two Unlinked Double-Strand Breaks
Can Induce Reciprocal Exchanges in Plant Genomes via Homologous Recombination and
Nonhomologous End Joining. Genetics, 175, 21 29.
35. Lin,Y., Fine,E.J., Zheng,Z., Antico,C.J., Voit,R.A., Porteus,M.H., Cradick,T.J. and Bao,G.
(2014) SAPTA: a new design tool for improving TALE nuclease activity. Nucleic Acids
Res., 42, e47 e47.
36. Hendel,A., Fine,E.J., Bao,G. and Porteus,M.H. (2015) Quantifying on- and off-target genome
editing. Trends Biotechnol., 33, 132 140.
37. Zhou,C., Sun,Y., Yan,R., Liu,Y., Zuo,E., Gu,C., Han,L., Wei,Y., Hu,X., Zeng,R., et al.
(2019) Off-target RNA mutation induced by DNA base editing and its elimination by
mutagenesis. Nature, 571, 275 278.
38. Xin,H., Wan,T. and Ping,Y. (2019) Off-Targeting of Base Editors: BE3 but not ABE induces
substantial off-target single nucleotide variants. Signal Transduct. Target. Ther., 4, 9.
39. Slaymaker,I.M., Gao,L., Zetsche,B., Scott,D.A., Yan,W.X. and Zhang,F. (2016) Rationally
engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science, 351, 84 88.
40. Kleinstiver,B.P., Pattanayak,V., Prew,M.S., Tsai,S.Q., Nguyen,N.T., Zheng,Z. and
Joung,J.K. (2016) High-fidelity CRISPR Cas9 nucleases with no detectable genome-wide
off-target effects. Nature, 529, 490 495.
41. Hajiahmadi,Z., Movahedi,A., Wei,H., Li,D., Orooji,Y., Ruan,H. and Zhuge,Q. (2019)
Strategies to Increase On-Target and Reduce Off-Target Effects of the CRISPR/Cas9
System in Plants. Int. J. Mol. Sci., 20, 3719.
42. Peterson,B.A., Haak,D.C., Nishimura,M.T., Teixeira,P.J.P.L., James,S.R., Dangl,J.L. and
Nimchuk,Z.L. (2016) Genome-Wide Assessment of Efficiency and Specificity in
CRISPR/Cas9 Mediated Multiple Site Targeting in Arabidopsis. PLoS One, 11, e0162169.
43. Qi,W., Zhu,T., Tian,Z., Li,C., Zhang,W. and Song,R. (2016) High-efficiency CRISPR/Cas9
multiplex gene editing using the glycine tRNA-processing system-based strategy in maize.
BMC Biotechnol., 16, 58.
44. Maghari,B.M. and Ardekani,A.M. (2011) Genetically modified foods and social concerns.
Avicenna J. Med. Biotechnol., 3, 109 17.
45. Ricroch,A.E. and Hénard-Damave,M.-C. (2015) Next biotech plants: new traits, crops,
developers and technologies for addressing global challenges. Crit. Rev. Biotechnol.,
10.3109/07388551.2015.1004521.
46. Sedeek,K.E.M., Mahas,A. and Mahfouz,M. (2019) Plant Genome Engineering for Targeted
Improvement of Crop Traits. Front. Plant Sci., 10.
47. Wang,F., Wang,C., Liu,P., Lei,C., Hao,W., Gao,Y., Liu,Y.-G. and Zhao,K. (2016) Enhanced
Rice Blast Resistance by CRISPR/Cas9-Targeted Mutagenesis of the ERF Transcription
32
Factor Gene OsERF922. PLoS One, 11, e0154027.
48. Bai,X., Wu,B. and Xing,Y. (2012) Yield-related QTLs and Their Applications in Rice
Genetic ImprovementF. J. Integr. Plant Biol., 54, 300 311.
49. Zuo,J. and Li,J. (2014) Molecular Genetic Dissection of Quantitative Trait Loci Regulating
Rice Grain Size. Annu. Rev. Genet., 48, 99 118.
50. Song,G., Jia,M., Chen,K., Kong,X., Khattak,B., Xie,C., Li,A. and Mao,L. (2016)
CRISPR/Cas9: A powerful tool for crop genome editing. Crop J., 4, 75 82.
51. Ma,X., Zhu,Q., Chen,Y. and Liu,Y.-G. (2016) CRISPR/Cas9 Platforms for Genome Editing
in Plants: Developments and Applications. Mol. Plant, 9, 961 974.
52. Li,M., Li,X., Zhou,Z., Wu,P., Fang,M., Pan,X., Lin,Q., Luo,W., Wu,G. and Li,H. (2016)
Reassessment of the Four Yield-related Genes Gn1a, DEP1, GS3, and IPA1 in Rice Using a
CRISPR/Cas9 System. Front. Plant Sci., 7.
53. Savary,S., Ficke,A., Aubertot,J.-N. and Hollier,C. (2012) Crop losses due to diseases and
their implications for global food production losses and food security. Food Secur., 4, 519
537.
54. Peng,A., Chen,S., Lei,T., Xu,L., He,Y., Wu,L., Yao,L. and Zou,X. (2017) Engineering
canker-resistant plants through CRISPR/Cas9-targeted editing of the susceptibility gene
CsLOB1 promoter in citrus. Plant Biotechnol. J., 15, 1509 1519.
55. Li,L., Piatek,M.J., Atef,A., Piatek,A., Wibowo,A., Fang,X., Sabir,J.S.M., Zhu,J.-K. and
Mahfouz,M.M. (2012) Rapid and highly efficient construction of TALE-based
transcriptional regulators and nucleases for genome modification. Plant Mol. Biol., 78, 407
16.
56. Oliva,R., Ji,C., Atienza-Grande,G., Huguet-Tapia,J.C., Perez-Quintero,A., Li,T., Eom,J.-S.,
Li,C., Nguyen,H., Liu,B., et al. (2019) Broad-spectrum resistance to bacterial blight in rice
using genome editing. Nat. Biotechnol., 37, 1344 1350.
57. Nekrasov,V., Staskawicz,B., Weigel,D., Jones,J.D.G. and Kamoun,S. (2013) Targeted
mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided
endonuclease. Nat. Biotechnol., 31, 691 693.
58. Golldack,D., Li,C., Mohan,H. and Probst,N. (2014) Tolerance to drought and salt stress in
plants: Unraveling the signaling networks. Front. Plant Sci., 5.
59. Haun,W., Coffman,A., Clasen,B.M., Demorest,Z.L., Lowy,A., Ray,E., Retterath,A.,
Stoddard,T., Juillerat,A., Cedrone,F., et al. (2014) Improved soybean oil quality by targeted
mutagenesis of the fatty acid desaturase 2 gene family. Plant Biotechnol. J., 12, 934 940.
60. Osakabe,Y. and Osakabe,K. (2014) Genome editing with engineered nucleases in plants.
Plant Cell Physiol., 10.1093/pcp/pcu170.
61. Shi,J., Gao,H., Wang,H., Lafitte,H.R., Archibald,R.L., Yang,M., Hakimi,S.M., Mo,H. and
Habben,J.E. (2017) ARGOS8 variants generated by CRISPR-Cas9 improve maize grain
yield under field drought stress conditions. Plant Biotechnol. J., 15, 207 216.
62. Lombardo,L., Coppola,G. and Zelasco,S. (2016) New Technologies for Insect-Resistant and
Herbicide-Tolerant Plants. Trends Biotechnol., 34, 49 57.
33
63. Li,J., Meng,X., Zong,Y., Chen,K., Zhang,H., Liu,J., Li,J. and Gao,C. (2016) Gene
replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR Cas9. Nat. Plants, 2,
16139.
64. Sauer,N.J., Mozoruk,J., Miller,R.B., Warburg,Z.J., Walker,K.A., Beetham,P.R.,
Schöpke,C.R. and Gocal,G.F.W. (2016) Oligonucleotide-directed mutagenesis for precision
gene editing. Plant Biotechnol. J., 14, 496 502.
65. Clasen,B.M., Stoddard,T.J., Luo,S., Demorest,Z.L., Li,J., Cedrone,F., Tibebu,R., Davison,S.,
Ray,E.E., Daulhac,A., et al. (2016) Improving cold storage and processing traits in potato
through targeted gene knockout. Plant Biotechnol. J., 14, 169 176.
66. Waltz,E. (2016) CRISPR-edited crops free to enter market, skip regulation. Nat. Biotechnol.,
34, 582 582.
67. Andersson,M., Turesson,H., Nicolia,A., Fält,A.-S., Samuelsson,M. and Hofvander,P. (2017)
Efficient targeted multiallelic mutagenesis in tetraploid potato (Solanum tuberosum) by
transient CRISPR-Cas9 expression in protoplasts. Plant Cell Rep., 36, 117 128.
Nature, 563,
306 307.
69. MacKenzie,D. (2019) A quarter of all pigs have died this year due to African swine fever.
New Sci.
70. Genius project (2012) https://www.inra-transfert.fr/en/actualites/102-8-projets/303-genius
71. Waltz,E. (2018) With a free pass, CRISPR-edited plants reach market in record time. Nat.
Biotechnol., 36, 6 7.
72. Editorial (2018) A CRISPR definition of genetic modification. Nat. Plants, 4, 233 233.
73. Friedrichs,S., Takasu,Y., Kearns,P., Dagallier,B., Oshima,R., Schofield,J. and Moreddu,C.
(2019) An overview of regulatory approaches to genome editing in agriculture. Biotechnol.
Res. Innov., 3, 208 220.
74. Mallapaty,S. (2019) Australian gene-
Nature,
10.1038/d41586-019-01282-8.
34