Esta es la versión HTML de un fichero adjunto a una solicitud de acceso a la información 'Request to EFSA for scientific opinion on "new GMOs"'.



Document 19
Ref. Ares(2020)1866468 - 01/04/2020
MINISTERIO PARA LA 
TRANSICIÓN ECOLÓGICA
DIRECCION GENERAL DE BIODIVERSIDAD Y CALIDAD 
AMBIENTAL 
Subdirección General de Calidad del Aire y Medio Ambiente 
Industrial 
Secretaría de la Comisión Nacional de Bioseguridad 
NATIONAL  BIOSAFETY  COMMISSION  REPORT  ON  THE  SITE  DIRECTED 
Background 
The European Court of Justice ruling of 25th July 2018 established that organisms obtained with the 
new site directed mutagenesis techniques, including the gene editing technologies, should be considered 
Genetically Modified Organisms (GMO) and therefore should be regulated by Directive 2001/18/CE 
of  the  European  Parliament  and  the  Council  of  12th  of  March  2001,  on  the  deliberate  release  of 
genetically modified organisms into the environment.  
In October 2018, the Interministerial Council for GMOs (CIOMG) requested an expert report to the 
National Biosafety Commission (CNB) in relation to: 1) the use of these techniques on the different 
biotechnological  sectors,  2)  the  potential  risks  to  the  health  and  the  environment  from  its  use  in 
comparison  to  other  genetic  modification  techniques  that  produce  GMOs  or  other  mutagenesis 
techniques used traditionally to modify plants and animals and 3) weigh up, from a scientific and a 
compliance control points of view, the European Court of Justice sentence on this matter.  
In the development of this report have participated not only the National Biosafety Commission experts 
but also an Ad-hoc expert group composed by representatives and researchers from the Biotechnology 
National Center-CSIC, the University of Lleida, the National Center for Biotechnology and Genomics 
of  Plants  (CBGP-UPM-INIA),  the  Spanish  Medicines  Agency  and  Medical  Devices  (AEMPS),  the 
University of Girona and the National Institute for Agricultural and Food Research and Technology 
(INIA). 
Introduction 
The basic gene editing methods developed until now are based on the generation of a cut in one or in 
the two strands of the DNA double helix as a result of a precise and directed cut in the editing region. 
This cut is later repaired by one of the cell two alternative mechanisms. (1) The preferential pathway is 
the non-homologous end-joining. This mechanism consists on the simple joining of the DNA ends and 
typically introduces additional mutations because it can lead to insertions or deletions during the repair 
process. (2) In the less frequent pathway, the homologous recombination, the nucleotide sequences are 
exchanged between two similar or identical molecules of DNA. It can use as template the related region 
of the homologous genome or an exogenous DNA molecule with sequence homology in the flanking 
cutting region and suitable to make the correct joint of the terminals. This edited genome is transmitted 
to the daughter cells.  
In the last decades different gene editing methodologies have been developed including methodologies 
based on nucleases to make site-specific double-stranded DNA breaks (i.e. Transcription Activator-
Like Effector Nucleases (TALEN), zinc-finger nucleases), based on genome modifications mediated 
by nucleic acids  (Oligonucleotide Directed Mutagenesis, ODM) or based  on a combination of both 
(CRIPSR/Cas9), allowing specific and precise alterations of the plant, animal or microorganism genome 
Plaza de San Juan de la Cruz s/n 
28071 MADRID 
TEL.: 91 597 5650 


   
 
 
 
 
These gene editing techniques are frequently used in basic research for  gene regulation studies,  for 
example in biomedicine, they are used for the generation of new cell and animal disease models. In 
plant biology these techniques are used for crops quality improvement, the generation of resistance to 
diseases or herbicides. In gene therapy they can be used to inactivate genes, repair mutations or even 
insert intact genes. In industrial biotechnology they are used for the biosynthesis of pharmaceutical, 
chemical or biofuel products, for biosensors development and for bioremediation. 
 
Risks associated to gene editing 
The implementation of gene editing techniques nowadays could imply the risk of introducing undesired 
mutations  in other genome regions (off-target  mutations) 1 and many  repaired DNA sequences  (on-
target mutations or genetic mosaicism), including the rearrangement of the edited genome which could 
be harmful and with unpredictable consequences2.  
 
Regarding plants, it has to be taken into account that natural genetic alterations can occur. Plants are 
constantly exposed to environmental stress like UV-B radiation, ozone, desiccation and rehydration and 
the air and ground pollution that can cause, as a response, the breakdown of one or the two DNA strands. 
The  repair  of  these  mutations  by  the  cell  endogenous  repair  mechanisms  described  before  could 
introduce errors, some of which could result in direct toxic effects such as reduction of protein synthesis, 
destruction of the cell membrane, the impair of the plant growth (by altering the photosynthetic protein) 
or to produce chromosome fusion or genetic changes in the plants that can be transmitted to the next 
generations.  Occasionally, these mutations are a source of natural variation, important for the plant 
evolution and useful for the crops improvement. 
 
Commonly,  mutations  in  plants  have  been  induced  by  using  chemical  substances  with  mutagenic 
properties  or  ionizing radiations.  These  techniques  cannot  be controlled  or  directed against  specific 
genes and also require a long selection process making very likely that the final selected products have 
additional mutations beyond the desired ones and some of them could be harmful. Many of the common 
plants for consumption obtained by these techniques have not been submitted to risk assessment and 
have not been a matter of safety concern; therefore it can be considered that the absence of incidents in 
their history of use is a proof of their safety.   
Gene  editing  techniques  are  more  specific  than  traditional  techniques  and  therefore  less  prone  to 
generate undesired mutations. Overall, the off-target mutations in plants are generally less frequent than 
the somatic mutations that can emerge from tissue cultures3. 
Many  efforts  have  been  done  to  improve  the  precision  and  efficiency  of  these  techniques,  such  as 
shortening the  activity time of the nucleases, avoiding homodimerizations  (TALEN and zinc-finger 
                                                          
1 Li, J.-F., Norville, J.E., Aach, J., McCormack, M., Zhang, D., Bush, J., Church, J.M. and Sheen, J. (2013) Multiplex and homologous 
recombination mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat. Biotechnol. 31(8), 
688 691.  
Shan, Q., Wang, Y., Li, J. et al. (2013) Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 31(8), 
686 688. 
Feng, Z., Mao, Y., Xu, N. et al. (2014) Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced 
gene modifications in Arabidopsis. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 111(12), 4632 4637. 
2 Wolt, J.D. (2017). Safety, security, and policy considerations for plan genome editing. Prog. Mol. Transl. Sci. 149, 215-241. 
3 Li, M., Li X., Zhou, Z., Wu, P., Fang, M., Pan, X., Lin, Q (2016). Reassessment of the four yield-related genes Gn1a, 
DEP1, GS3, and IPA1 in rice using a CRISPR/Cas9 system. Front.Plant Sci. 7,377 
Página 2 de 5 
 


   
 
 
 
proteins), transforming nucleases into nickases and thus originating the breakdown of the DNA single 
strand instead of breaking the double strand, developing of more specific Cas nucleases, modifying the 
DNA coupling, developing bioinformatic tools for the desing of these instruments4 and the design of 
tools to characterize and detect these off-target regions5. 
 
Regarding  their  application  to  animals,  the  use  of  these  techniques,  and  more  specifically,  the 
CRISPR/Cas9 methodology, has proven to be able, relatively quickly and routinely, to produce discreet 
genomic changes both in embryonic pluripotent stem cells and in embryos. The previous approaches 
that tried to produce similar modifications were arduous and often left behind large alterations as the 
introduction of antibiotic selection genes that required a second step for its removal.  
 
However, this technique has the inconvenience of producing mosaic mutations in a way that some cells 
carry the desired modification, other cells carry undesired modifications and other cells do not carry 
any modification. To reduce the formation of mosaic animals, the genome editing must be carried out 
at an early development point so that all cells of the organisms have the edited sequence. Moreover, 
although  the  underlying  mechanisms  of  the  mosaic  mutations  produced  by  CRISPR/Cas9  are  still 
unknown, the expression and prolonged activity of Cas9 in embryos could contribute to its creation6. 
For this reason Ribonucleoproteins (RNP) ( CRISPR/Cas9 that have a limited temporary activity range 
are  currently 
ex  vivo
techniques can be considered safe because the desired clones could be selected while the use of this 
in vivo
considered safe.  
 
In human cancer cell lines it was observed more than 50% of  off-target mutations  compared to  the 
mutations in the specific sequence because in these cells, the DNA repair mechanisms are defective7. 
When stem cells were used, the whole-genome sequencing showed an absence of off-target mutations8 
or only few events9. On the other hand, it has been demonstrated in animals that gene editing could 
introduce a response in the cells aiming to protect against the DNA damage. This response involves p53 
DNA  breaks.  .It  has  been  found  that 
CRISPR/Cas9  works  more  efficiently  in  human  pluripotent  stem  cells  with  impaired  p53  genes. 
Nevertheless, these cells are the ones that have the highest predisposition to transformation into tumoral 
cells. Therefore, the insertion in a patient of cells modified with CRISPR/Cas9 tools and with low or 
                                                          
4 Bortesi L, Zhu C, Zischewski J, Perez L, Bassié L, Nadi R, Forni G, Lade SB, Soto E, Jin X, Medina V, Villorbina G, 
Muñoz P, Farré G, Fischer R, Twyman RM, Capell T, Christou P, Schillberg S (2016). Patterns of CRISPR/Cas9 activity in 
plants, animals and microbes. Plant Biotechnol J. 2016 Dec;14(12):2203-2216.  
5 Cameron, P., Fuller, C. K., Donohoue, P.D., Jones, B. N.,Thompson, M.S., Carter, M.M., (2017). Mapping the genomic 
landscape of CRISPR/Cas9 cleavage. Nat. Methods 14, 600-606. 
6 Tu, Z1., Yang, W., Yan, S., Yin, A., Gao, J., Liu, X., Zheng, Y., Zheng, J., Li, Z., Yang, S., Li, S., Guo, X., Li, X. J. Sci Rep. 2017 Feb 
3;7:42081. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. 
7 Fu, Y., Foden, J.A., Khayter, C., Maeder, M.L., Reyon, D., Joung, J.K. and Sander, J.D. (2013). High-frequency off-target mutagenesis 
induced by CRISPR Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822 826. 
Hsu, P.D., Scott, D.A., Weinstein, J.A., Ran, F.A., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y. (2013). DNA targeting specificity of RNA-guided 
Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 31, 827 832. 
Kim, D., Bae, S., Park, J., Kim, E., Kim, S., Yu, H.R., Hwang, J.  (2015). Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-
target effects in human cells. Nat. Methods, 12, 237 243. 
8 Smith, C., Gore, A., Yan, W., Abalde-Atristain, L., Li, Z., He, C., Wang, Y. (2014). Whole-genome sequencing analysis reveals high 
specificity of CRISPR/Cas9 and TALEN-based genome editing in human iPSCs. Cell Stem Cell, 15,12 13. 
9 Veres, A., Gosis, B.S., Ding, Q., Collins, R., Ragavendran, A., Brand, H., Erdin, S. (2014). Low incidence of off-target mutations in 
individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell, 15, 27
30. 
Página 3 de 5 
 


   
 
 
 
null p53 activity could increase the risk that the patient develops a cancer10, so it must be ensured that 
the cells administered to the patient have intact p53 activity.  
 
Furthermore, it has been proven that most of the individuals have circulating antibodies directed against 
the two most common forms of the Cas9 protein used in CRISPR, derived from two Gram positive 
pathogen  bacteria:  Staphylococcus  aureus  and  Streptococcus  pyogenes  that  causes  nosocomial 
infections (in hospitals) or laryngitis/otitis, respectively, and thus our immune system has developed 
both  antibodies  and  lymphocytes  against  these  bacteria  and  their  components,  including  the  Cas9 
nucleases,  and  this  could stop  the application  of this  technology in  field  trials11,  unless  an  immune 
suppression therapy is co-administered. In this sense, work is being done to find cas genes from other 
bacterial and archea species of other ecological niches to which the human population has not been in 
contact and for which humans are not immunized. Studies are also being done to generate synthetic Cas 
proteins not recognized by the human immune system. 
 
CONCLUSIONS 
As previously stated at the beginning of this report, the European Court of Justice ruling on mutagenesis 
considers  that  the  organisms 
conventionally  and  having  a  long  safety  record,  are  still  out  of  the  scope  of  the  GMO  regulation. 
However,  this  verdict  assumes  that  the  risk  associated  with  the  use  of  site  directed  mutagenesis 
techniques (including gene editing) could be similar to the risks of GMOs obtained by techniques that 
involve  the  incorporation  of  foreign  genetic  material  into  an  organism  (transgenesis).  In  this  sense 
regarding the latter, it should be noted that after more than 30 years of studies on GMOs to date, no 
undesirable adverse effects on health or the environment have been detected.  
The directed mutagenesis in this aspect is placed within the techniques with minimal risk due to its 
specificity and selection. 
Prior to gene editing techniques, the introduction of novel traits into organisms by genetic engineering 
was mainly based on the use of techniques with stable insertions but random genetic modifications (for 
example,  conventional  mutagenesis)  or  foreign  genetic  material  (transgenesis).  Due  to  randomness, 
undesirable  alterations  in  the  genome  can  occur,  such  as  interruption  of  genes  and/or  regulatory 
elements, or the creation of new open reading frames (for example, with a similar sequence to toxins or 
known allergens), which explains why the processes of selecting GMOs with desirable traits are often 
complicated and time-consuming. The use of gene editing techniques offers the possibility of reducing 
the likelihood of these unwanted adverse effects, since it provides a way to address a predefined locus 
of  the  genome,  together with  a  rapid  subsequent  selection  to  achieve  the  desired  genetic  alteration, 
discarding all the others that may have been generated.  
 
Regarding plants, gene editing can give rise to varieties that are not genetically differentiated from those 
that carry the same modification generated spontaneously, developed by introgression of the desired 
gene  through  successive  crosses  or  induced  by  traditional  mutagenesis  and  yet,  the  regulatory 
requirements  for  each  of  these  varieties  would  be  different  which  is  difficult  to  understand  from  a 
scientific point of view. For many products it is difficult, if not impossible, to have a detection method. 
                                                          
10 Leslie K. F. CRISPR, cancer, and p53. Sci. Signal. 17 Jul 2018:Vol. 11, Issue 539. 
11 Carsten, T. Ch., Priyanka, S. D., Daniel, P. D., Beruh, D., Natalia, G.-O., Sruthi, M., Mara, P.-D., Joab C., Kenneth, W.,, Matthew, H. 
P. Identification of Pre-Existing Adaptive Immunity to Cas9 Proteins in Humans, bioRxiv preprint first posted online Jan. 5, 2018. 
Página 4 de 5 
 


   
 
 
 
In the event that the technique used to obtain certain modifications is not reported, it will not be possible 
to  differentiate  if  they  have  been  obtained  by  gene  editing  techniques  or  any  of  the  non-regulated 
techniques.  
 
Taking  into  account  the  difficulties  for  detection,  identification  and  quantification,  a  challenging 
scenario  is  presented  to  also  comply  with  the  obligations  set  out  in  the  directive  regarding  the 
traceability and labeling of GMOs, which will be even more difficult for varieties obtained through 
these techniques that come from countries whose legislation does not consider them  as GMOs, and 
these, definitely, will soon begin to reach our consumer markets.  
 
The National Biosafety Commission already included its opinion in its November 2015 report on new 
plant  breeding  techniques  (NPBT),  as  to  whether  the  products  obtained  through  the  use  of  these 
techniques  should  be  considered  as  GMOs.  This  report  indicates  that  in  order  to  determine  if  an 
organism falls within the scope of Directive 2001/18/EC, the product, and not the technique with which 
it is obtained, should be evaluated, and the safety of the product should be established based on its new 
characteristics,  the  environment  in  which  it  is  grown  and  agricultural  practices,  for  plants,  and  the 
human and animal exposure. 
 
For  all  these  reasons  and  in  view  of  the  fast  development  of  these  new  biotechnological  tools,  the 
National Biosafety Commission considers that clarifications are still needed on some implementation 
issues by European bodies, but also calls for a revision of the current GMO regulation to reflect the 
latest knowledge and, based on scientific and technical evidence, ensure the health and the environment 
safety. If the legislation is not updated, important consequences could occur for the EU citizens, the 
international trade, cooperation with developing countries, and also for European scientific progress. 
 
In  this  regard,  we  would  agree  with  the  report  of  the  Scientific  Advisory  Group  of  the  European 
Commission12 that "It is necessary to improve EU legislation on GMOs so that it is clear, evidence-
based,  applicable,  proportionate  and  sufficiently  flexible  to  face  future  advances  in  science  and 
technology in this area. To achieve this, we recommend reviewing the current GMO Directive to reflect 
current  knowledge  and  scientific  evidence,  in  particular  on  gene  editing  and  established  genetic 
modification techniques. This must be done in relation to other relevant legislation for food safety and 
environmental protection". 
 
Madrid, 14 of January of 2019 
                                                          
12 https://ec.europa.eu/info/sites/info/files/2018_11_gcsa_statement_gene_editing_2.pdf 
Página 5 de 5